胆管树干细胞在肝脏和胰腺再生中的研究进展

杨 勇， 时 军， 何志颖， 张文成

(1. 同济大学附属东方医院再生医学研究所，上海 200123； 2. 南昌大学第一附属医院普通外科，南昌 330006；3. 同济大学附属东方医院干细胞转化医学产业基地，上海 200123； 4. 上海市东方医院吉安医院·同济大学附属东方医院吉安医院普外科，江西 吉安 343006)

终末期肝病(end-stage liver diseases, ESLDs)泛指各种肝损伤所导致的肝病晚期阶段，主要表现为肝功能严重受损和失代偿。ESLDs是一个高发病率、高死亡率的全球性公共卫生问题，是危害国民健康和增加经济负担的重大疾病[1]。据世界卫生组织统计，全球每年因ESLDs死亡者约300万。我国作为乙肝大国，目前乙肝病毒感染者将近9 000万例，其中20%～30%将发展为ESLDs。糖尿病是一类以胰岛素分泌缺陷导致的高血糖为特征的代谢性疾病，分为先天性的1型和后天性的2型糖尿病。目前，全球9%～10%人口罹患糖尿病，每年大约400万人死于糖尿病及其相关疾病。截至2019年，我国糖尿病患者116.4万，居全球发病人数之首[2]。

目前，通过原位肝移植可实现对ESLDs的有效治疗，而胰岛移植也同样为糖尿病患者的功能性修复提供了有效治疗手段。然而，无论是肝移植还是胰岛移植，供体器官的来源受限、移植后免疫抑制剂的终身使用等问题极大地阻碍了这些有效治疗手段在ESLDs和糖尿病治疗中的应用和推广。近年来，细胞移植，尤其是干细胞移植治疗ESLDs和糖尿病的临床前研究和部分临床研究取得了令人瞩目的成果，为ESLDs和糖尿病的治疗带来了新契机，有望成为治疗ESLDs和糖尿病新的有效手段。

筛选和确定可用于疾病治疗的干细胞类型是开展干细胞对ESLDs和糖尿病治疗的基础。研究表明，人胆管树管壁的胆周腺体(peribiliary glands, PBs)内存在多潜能干细胞——人胆管树干细胞(human biliary tree stem cells, hBTSCs)。这些hBTSCs表达定型内胚层(definitive endoderm, DE)特异性转录因子及早期干细胞表面分子标志，通过体外诱导可以分化为肝脏、胆管和胰腺内分泌腺的功能性细胞。移植hBTSCs可以有效地挽救肝损伤和糖尿病模型小鼠，在基于干细胞的ESLDs和糖尿病治疗中展现出巨大的临床应用前景[3-4]。本述评围绕hBTSCs，结合胆管及其相关组织的胚胎发育过程、解剖学特征、hBTSCs谱系分化分布特征及分子标志、体外扩增特性、基础及临床研究现状等，对hBTSCs的基础研究和应用潜能进行详细的阐述，并对hBTSCs应用转化中面临的细胞异质性、向功能性细胞分化成熟不完全等亟待解决的问题进一步进行探索，以期推动hBTSCs在ESLDs和糖尿病治疗中的应用。

1 胆管树解剖结构、基本生理功能及其发育形成

胆管树是连接肝脏、胆囊、胰腺和十二指肠的共同通道，其主要功能是贮存、浓缩和输送胆汁，以及收集胰腺外分泌腺分泌的胰蛋白酶和消化液等[5-6]。人胆管树系统包括肝内胆管、肝外胆管和胰管，其管腔由胆管上皮构成，且部分胆管上皮可内陷形成被称为胆周腺的结构[7]。肝内胆管包括毛细胆管、赫令管、小叶间胆管、肝段与肝叶胆管以及肝内部分的左右肝管。肝外胆管主要包括肝总管、胆囊与胆囊管、胆总管和肝胰总胆管[8]。胰管包括主胰管和副胰管，主胰管贯穿整个胰腺，在靠近十二指肠肌层部位与胆总管汇聚，形成肝胰总胆管。肝胰总胆管穿过十二指肠肌层并开口于十二指肠大乳头，是胰腺消化酶输送和排放至十二指肠的主要通道。另外，副胰管也会与十二指肠直接连接，形成十二指肠小乳头。

经典发育生物学认为，胆管是前肠内胚层器官。哺乳动物胚胎早期发育中形成内、中、外三个胚层，消化系统和呼吸器官主要由内胚层发育形成。通过一系列关键转录因子的作用，内胚层先分化形成原肠，原肠分为前肠、中肠和后肠三段。在胚胎发育第4周，肝脏、胆囊和胰腺以芽生形式在前肠末端区域形成[9]。肝芽最终主要形成肝实质和肝内胆管，胆囊芽形成胆囊、肝外胆管和部分肝内胆管。胰芽包括靠近胆囊芽的腹侧胰芽和在中肠位置的背侧胰芽两部分，随着胚胎发育和胃肠道的成型，腹胰会通过扭转的方式与背胰合并，形成胰腺[10-11]。

对于胆管胚胎发育中转录调控机制的研究证实，胆管发育形成过程与转录因子Y染色体性别决定区域盒17(sex determining region Y-box 17, Sox17)和胰-十二指肠同源盒1(pancreas/duodenum homeobox protein 1, Pdx1)的表达密切相关。关于这两个转录因子功能的研究表明，成熟肝细胞和肝内胆管来源于Pdx1-细胞，而肝外胆管和胰腺细胞则来源于Pdx1+细胞。倘若对小鼠胚胎的Sox17进行敲除，获得的Sox17敲除小鼠显现明显的肝外胆管系统发育不全，但肝内胆管系统形成不受影响[12]。这进一步证实肝外胆管和肝内胆管发育形成机制有所不同。目前的理论认为，肝内胆管是肝芽形成肝板后，肝细胞通过极性改变而形成，而肝外胆管则由靠近腹侧胰芽的胆囊芽发育形成。当然，胆囊芽同样也会形成部分肝内胆管，从肝板形成的肝内胆管和胆囊芽形成的肝内胆管之间的差异还有待进一步研究。

2 胆管树干细胞及其谱系研究

基于组织化学的研究证实，胆管树壁内胆周腺内存在表达DE干细胞标志(Sox17、Pdx1、FoxA2)，上皮干细胞标志(EpCAM、Sox9、Lgr5)以及部分胚胎干细胞多能性标志(Oct4、Sox2)的干细胞。Cardinale等[13]和Wang等[14]通过细胞分离方法获得可在体外分化为功能性肝细胞、胰岛β细胞和胆管上皮细胞的干细胞，并命名为hBTSCs。研究发现hBTSCs从胚胎期到成年均存在于人的胆管树的胆周腺内，但因所处胆管树的位置不同，hBTSCs具有明显的异质性[15-16]。例如，处于肝胰总胆管的hBTSCs向肝、胰腺分化的潜能要高于胆管树其他部位的hBTSCs。而除肝胰总胆管以外肝外胆管中的hBTSCs几乎不具有分化为胰岛细胞的潜能，且肝胰总胆管以外的主胰管和副胰管中的hBTSCs向肝细胞分化的效率和潜能也极其有限[17]。除此之外，即使在干性最为原始的hBTSCs富集的肝胰总胆管同一位置，镶嵌在管腔深层的胆周腺内hBTSCs其原始干性标志的表达(如Oct4、Sox2等)，要明显高于靠近管腔表面的胆周腺内hBTSCs[18]。这些复杂的分布模式，给hBTSCs的异质性的研究带来了极大的挑战。

近年来，单细胞转录组测序的发展为器官内组成细胞类型的异质性研究提供了强大的工具。目前通过单细胞转录组测序、单细胞核转录组测序、空间转录组测序等技术，已经对正常和疾病状态下的肝脏、胰腺、肺的细胞类型和谱系分布进行了明确和绘制[19-20]。单细胞测序通过对组织构成细胞类型进行直接分析，结合已知的干细胞特异性标志，对获得的细胞群体进行定性后，可以为每一种已知的细胞类型提供未知的标志和研究方法[21]。通过早期研究，一些hBTSCs标志物已经初步确定。Semeraro等[22]发现在人胚胎期胆管组织的胆周腺中存在Epcam+Pdx1+Sox17+细胞，这些细胞可以在特定条件下进行扩增，也能在体内和体外被诱导分化为肝细胞和胆管上皮细胞，但活体移植试验显示这些细胞在体内不能形成明显的囊管状结构。Cardinale等[4]发现人肝外胆管胆周腺内细胞表达特异性的干细胞转录因子(Sox9、Sox17、Pdx1、Foxa2、Hes1、Ngn3、Prox1)，也表达干细胞的一些表面分子标志(Epcam、Ncam、CD133和Cxcr4)。然而，利用这些表面标志物进行筛选，获得的细胞只有部分具有干细胞的形态和特性。因此，通过开展单细胞转录组学研究，将有望获得可用于特异性筛选和富集hBTSCs的表面标志物，实现对hBTSCs谱系分布的绘制，为hBTSCs的体外扩增、分化和开展对ESLDs、糖尿病的移植治疗提供充足且均质的种子细胞。

3 胆管树干细胞的体外扩增特性

实现hBTSCs的体外扩增和传代，从而获取足够量的细胞，是细胞移植治疗ESLDs和糖尿病的基础。建立良好的体外扩增体系则是维持细胞干性及细胞正常生理功能的关键。早期已经建立的其他内胚层器官干细胞(如胃肠道干细胞、肝干细胞等)的体外扩增体系，为hBTSCs的规模化扩增提供了参考。这些培养体系主要包括共培养和Matrigel基底胶培养。

利用共培养体系，Manohar等[23]实现了对胆囊来源上皮细胞的扩增。扩增体系分为上下两层，上层为分离的胆囊上皮细胞，下层为饲养层细胞。饲养层细胞经钴源照射后会停止分裂增殖，但可持续为上层细胞的扩增提供生长因子。通过这种共培养方法，胆囊上皮细胞可以长期稳定传代。鉴于共培养体系操作的繁杂和饲养层制备过程可能出现污染等问题，基于Matrigel基底胶的培养体系逐渐成为实现内胚层器官来源上皮干细胞体外扩增的首选方法。Matrigel基底胶是从小鼠软骨肉瘤中提取的基质成分，其主要成分包括层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素等黏多糖生长因子及基质金属蛋白酶等[24]。Matrigel基底胶可在室温条件下模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，促进干细胞的体外维持和扩增。因此，在Matrigel基底胶的基础上，通过在基础培养基中添加EGF(激活EGF信号通路)、R-Spindin1(激活Wnt信号通路)、Noggin(BMP信号通路的抑制剂)、FGF10(激活FGF信号通路)、WNT3a(激活Wnt信号通路)等生长因子，Barker等[25-26]实现了对肠道干细胞和肝干细胞的长期培养扩增。Huch等[27]通过Matrigel基底胶体系在体外对肝干细胞进行长期培养并使之形成类器官，时间长达数月之久。经该体系扩增的类器官在移植至肝衰模型小鼠后能够分化为功能性的肝细胞以挽救其肝功能衰竭。

除此之外，小分子化合物在内胚层干细胞的扩增中也发挥着关键作用。Wang等[28]利用小分子化合物(转化生长因子-超家族Ⅰ型激活素受体样激酶受体ALK4、ALK5和ALK7的有效抑制剂SB431542，非ATP竞争性MEK抑制剂PD0325901，G9a样蛋白和G9a组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂Bix01294，DNA甲基转移酶的非核苷抑制剂RG108，钙离子通道抑制剂Bay K 8644等)，从胃肠道黏膜上皮细胞获得诱导内胚层干细胞(human induced endodermal progenitor cells, hiEndoPCs)，这些hiEndoPCs可以在该小分子化合物培养基中扩增至少5代。

由于hBTSCs是接近DE的干细胞，因此理论上认为DE的扩增体系更适用于hBTSCs的扩增[29]。Cheng等[30]在小鼠胚胎滋养层和Matrigel基底胶结合的基础上，通过添加细胞因子组合(BMP4、bFGF、EGF和VEGF)，将DE在体外扩增24代，实现细胞数量从1到1.0×1016的放大。该方法和体系的建立，以及其他上述内胚层干细胞扩增体系的研究，都将为hBTSCs的体外扩增体系的确定提供经验和参考。

4 胆管树干细胞的临床转化研究进展

自1992年实施第1例肝细胞移植治疗代谢性肝病以来[31]，目前大多数肝细胞治疗肝病的临床试验结果并不理想。造成肝细胞移植后效果不佳的主要原因有移植肝细胞无法增殖、移植产生免疫排斥反应等。相比较肝细胞，hBTSCs具有取材方便、低免疫原性、无年龄限制、移植后的效果长久且细胞具有体外增殖能力等优点，在ESLDs和糖尿病的治疗中具有巨大的应用前景。

目前对于hBTSCs用于ESLDs和糖尿病的进展还处于基础研究阶段。基于hBTSCs的向肝细胞诱导分化的研究表明，hBTSCs在体内和体外均可分化成为肝干细胞(hepatic stem cells, hHpSCs)，hHpSCs则可通过分化为肝祖细胞(hepatoblast，hHBs)，进一步形成胆管上皮细胞和成熟肝细胞[15]。研究已经开展了基于胎儿来源的hHpSCs移植治疗ESLDs的临床试验[32]。该试验通过对胎肝中的EpCAM+hHpSCs进行分选纯化后，直接经门静脉对两例入组患者进行EpCAM+hHpSCs细胞移植。移植后1年内，在未使用免疫抑制剂的情况下，接受细胞移植的两位患者均未出现免疫反应并发症，并且两名患者在6个月随访中都表现出生化指标和临床症状改善，其中女性入组患者的MELD 评分持续呈下降趋势，并保持12个月以上的肝功能指标改观。由于hBTSCs是较EpCAM+hHpSCs更为原始的干细胞类型，尤其是胎儿来源的hBTSCs其HLA-Ⅱ类抗原蛋白几乎不表达[33]。因此，移植hBTSCs可能具有比EpCAM+hHpSCs更佳的疾病治疗的优势，这将为hBTSCs的临床应用提供良好的借鉴。

为了确保为临床应用提供及时可用的hBTSCs，Nevi等[34]建立了含15%人血清白蛋白的hBTSCs细胞冻存体系。该体系通过添加0.1%的透明质酸，可使冻存复苏后的hBTSCs维持与原代分离的hBTSCs相当的细胞活性和干细胞特性，这为供体hBTSCs细胞存储库的建立奠定了基础。其中，透明质酸作为糖胺聚糖的一种，是构成体内hBTSCs干细胞微环境的主要细胞外基质类型，在hBTSCs体外维持、冻存和移植中都发挥着关键和重要的作用。

Turner等[35]将hHpSCs与交联的透明质酸水凝胶混合后进行肝脏原位注射移植，发现hHpSCs在肝损伤模型小鼠肝脏内的定植效率和定植时间得到了极大提高。同样，Nevi等[34,36]发现，用透明质酸对hBTSCs进行包被后再移植，其定植效率明显高于对照组(11%vs3%)。同时值得注意的是，透明质酸包被同样也可以提高hBTSCs移植后在肝脏内向肝细胞分化成熟的效率。对于包被的hBTSCs，随着其分化成熟，小鼠肝脏内人白蛋白的基因表达水平会增加10倍，而未包被的细胞其人白蛋白血清水平只增加了2倍。因此，与透明质酸水凝胶或者透明质酸混合液混合后进行移植，可能是hBTSCs临床转化应用中关键并行之有效的环节之一。

尽管通过以上的研究已经初步建立了hBTSCs的移植策略，但即使混合透明质酸，倘若通过血液血管途径进行hBTSCs移植，hBTSCs在小鼠肝脏内定植的效率依然低于20%。虽然通过直接注射的方式确实可以提高移植部位的细胞的移植效率，然而这种伴随创伤而实现移植的方法在临床转化应用中难以推广。为了克服由于通过血管途径移植所造成的hBTSCs在肝脏和胰腺内定植效率低等问题，Zhang等[37]利用大动物(猪)和小动物(小鼠)的BTSCs，在猪和小鼠体内建立了补片移植技术(patch grafting)。在该移植策略中，猪和小鼠的BTSCs首先在无血清培养基中形成类器官体，并包埋至合适机械力的透明质酸凝胶中，再将BTSCs类器官体和透明质酸凝胶的混合物组合至无免疫原性的手术辅料之上，形成一个干细胞补片移植复合物。该补片可以直接通过手术或腹腔镜的方法，缝合至肝脏或者胰腺的表面。BTSCs在移植后1周内可实现其向肝脏和胰腺移植部位的高效移植，并在2～3周内向功能性肝细胞和胰岛β细胞分化，参与到肝损伤或胰岛损害的修复中。这些基础和应用研究都为hBTSCs在ESLDs和糖尿病治疗方面的转化应用提供了扎实的科学依据和理论支持。

5 尚待解决的问题

hBTSCs作为具有分化为功能性肝细胞、胰岛β细胞和胆管上皮细胞等潜能的成体干细胞类型，围绕其开展的基础和转化研究开始受到越来越多的关注。hBTSCs研究的推动离不开多领域的合作。对于hBTSCs的分离纯化依赖于经典的解剖学、组织化学方法，同时也依赖于经典的测序和单细胞转录组测序的研究方法。对hBTSCs的扩增涉及细胞外基质相关的大分子合成化学、细胞因子相关信号通路等细胞生物学、分子生物学的研究手段。对于hBTSCs向功能性肝细胞、胰岛β细胞和胆管上皮细胞的功能性成熟囊括糖生物学、代谢组学、体外功能性验证平台和体内实验动物模型等研究策略。而对于hBTSCs的高效移植及对其移植后在移植器官内的命运转归的研究，涉及疾病动物模型的建立、体内示踪、药效学和安全性评价等研究。针对hBTSCs纯化、扩增、分化、移植的各个环节中的关键科学和技术问题的开展及其临床转化应用，将需要更多的各个领域的科学家协同完成，共同实现。

6 展 望

胆管树作为肝脏和胰腺发育过程中的伴随发育器官，其胆周腺内的hBTSCs是肝脏和胰腺功能损伤修复的理想种子细胞。目前已有的研究从基因、细胞、发育、动物实验等方面证实hBTSCs可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺内分泌细胞，移植hBTSCs的糖尿病小鼠可以恢复其血糖调节功能，这些基础和应用研究都证明hBTSCs是一种具有组织再生修复功能的内胚层干细胞类型。对于针对hBTSCs体外扩增、功能成熟和移植后细胞命运转归的深入研究，将进一步推进hBTSCs的临床转化应用，为ESLDs和糖尿病患者的治疗提供新的有效的治疗方案。