GW501516对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖的作用及其机制*

陈昌贵， 贺立群， 田立群， 易春峰

(武汉市第一医院心血管内科, 湖北 武汉 430022)

持续性低氧可导致非肌型肺小动脉肌化、血管壁的内膜增厚、管腔狭窄甚至闭塞从而使肺动脉压力增加。长期过高的肺动脉压力会导致右心功能衰竭而死亡。肺血管重构是低氧肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)持续发展的病理生理基础，低氧诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)异常增殖在低氧肺血管中起着至关重要的作用[1, 2]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是核激素受体家族中的配体激活受体，包含3种亚型：PPARα，PPARγ和PPAR δ(也称PPAR β/δ)。PPAR的活化能够调节多种生物学过程，包括能量稳态，细胞增殖和分化，葡萄糖代谢，脂肪酸合成及分解代谢。既往研究发现，PPAR δ具有改善胰岛素抵抗、抑制炎症反应、抗氧化应激、抗动脉粥样硬化等作用[3, 4]。GW501516也称为GW-1516，Cardarine或Endurobol，是葛兰素史克研制的一种PPARδ特异性激动剂，其可促进脂肪代谢，增加骨骼肌对葡萄糖的利用，提高运动耐力，动物实验表明其具有减肥作用，国外黑市上有部分人购买GW501516用于减肥增肌，但是其长期口服安全性有待进一步研究[5,6]。在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖模型中发现，GW501516能够阻滞VSMCs于G0/G1期，抑制其增殖[7]。另有研究表明，GW501516能够通过抑制蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)活化抑制血管紧张素II诱导的VSMCs肥大[8]，而AKT信号通路能够促进低氧PASMCs增殖[9]。因此本研究观察PPARδ激动剂GW501516对低氧条件下PASMCs增殖的影响，并探讨其可能机制，为低氧肺血管重构的防治寻找新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重170～190 g SPF级别雄性SD大鼠购自北京维通利华动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2 试剂

I型胶原酶、GW501516、SC79、DMSO、RNase(RNA酶)、Triton X-100、 溴化乙锭(PI)等购自Sigma公司； CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；BrdU试剂盒购Roche公司；DMEM/F12培养基、青霉素/链霉素双抗溶液、胎牛血清、胰酶等购自Hyclone公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，TRIzol购自Invitrogene公司；PPARδ抗体、T-AKT与P-AKT抗体、T-GSK3β与P-GSK3β抗体、GAPDH抗体购自Sigma公司。

1.3 仪器

细胞培养箱 ( Thermo，3131 )，多功能酶标仪( Bio-tek公司，Synergy HT)，荧光定量PCR仪(Roche公司，LightCycler 480)，双色红外荧光扫描仪(Odyssey公司， LI-COR)。

1.4 SD大鼠PASMCs原代培养

采用浓度为0.2% I型胶原酶消化分离PASMCs[10]，使用含20%胎牛血清DMEM/F12培养基培养PASMCs，传至第3代时，性状稳定，通过显微镜观察PASMCs进行形态学鉴别，免疫组织化学检测SM-α-actin进行PASMCs鉴定(本研究细胞纯度>95%)，本研究所用PASMCs为4～10代细胞。

1.5 实验分组

本研究选用GW501516浓度为10～100 nmol/L，SC79浓度为10 μmol/L[11]。筛选GW501516抑制低氧PASMCs增殖最适浓度实验分为5组，每组设6个复孔:对照组：0.1%DMSO；低氧组：0.1%DMSO+低氧；GW501516低、中、高剂量低氧组：不同浓度的GW501516 (10、30、100 nmol/L)+低氧。低氧及GW501516对PPARδ的表达的影响分为3组，每组设6个复孔：对照组：0.1%DMSO；GW501516组：100 nmol/L GW501516；低氧组：0.1%DMSO+低氧。GW501516抑制低氧PASMCs增殖机制相关实验分为4组，每组设6个复孔：对照组：0.1%DMSO；低氧组：0.1%DMSO+低氧；GW501516低氧组：100 nmol/LGW501516+低氧；GW501516+SC79低氧组：100 nmol/LGW501516+10 μmol/L SC79+低氧。GW501516与SC79均溶解于DMSO储存于-20℃，进一步使用时采用DMSO稀释。对照组采用含21%氧气，5%二氧化碳，74%氮气培养，低氧组采用含 3%氧气 、5%二氧化碳和92%氮气培养[12]，当细胞融合度达到70%左右时，采用不含血清的培养基培养细胞24 h后分别进行常氧或低氧培养处理，GW501516低氧组与GW501516+SC79低氧组在低氧培养前给予GW501516或(和)SC79预处理2 h后进行干预。

1.6 CCK-8检测细胞增殖

PASMCs以5×103cells/well均匀接种于96孔板中，每孔含培养基100 μl，各组细胞干预后,按照CCK-8试剂盒使用说明在96孔板每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育3 h，采用酶标仪测定450 nm吸光度，计算细胞的相对增殖。

1.7 BrdU试剂盒检测DNA的合成

PASMCs以5×103cells/well均匀接种于96孔板中，各组细胞干预后，每孔加入10 μl BrdU标记液，孵育2 h后移去标记液，按照试剂盒操作步骤依次加入FixDenat solution，anti-BrdU-POD工作液，Substrate solution后酶标仪测定450 nm吸光度，计算DNA的相对含量。

1.8 流式细胞仪检测细胞周期

PASMCs以 1.5×105cells/well均匀接种于6孔板中，各组细胞干预后，采用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后加入70%乙醇(无水乙醇+PBS溶液)固定过夜，离心后加入485 μl PBS重悬细胞、Triton X-100 1 μl、1 mg/ml RNA酶 5 μl、 1 mg/ml PI 10 μl，4℃避光孵育30 min后，通过流式细胞仪检测细胞周期，modifit软件分析数据。

1.9 RT-PCR检测mRNA的表达

PASMCs以 1.5×105cells/well均匀接种于6孔板中，各组细胞干预后，使用TRIzol试剂提取总RNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，分光光度计测量RNA的质量和浓度。按照反转录试剂盒操作步骤将mRNA逆转录为cDNA，再经PCR技术扩增，以GAPDH作为内参标准化RNA的含量。所用引物序列为: CyclinD1: 上游 5'-GAGACCATCCCCCTGACGGC-3'，下游 5'-TCTTCCTCCTCCTCGGCGGC-3'；P27：上游 5'-TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA-3'，下游5'-CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACAAGGA-3'；GAPDH：上游 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'

1.10 Western blot检测蛋白的表达

PASMCs以 1.5×105cells/well均匀接种于6孔板中，各组细胞干预后，通过细胞裂解液提取细胞总蛋白，通过BCA法测量样本总蛋白浓度，变性后每个样本取15 μg总蛋白进行凝胶电泳，转膜后依次进行封闭、漂洗、一抗孵育、二抗孵育，再次漂洗后Odyssey系统读取蛋白的灰度值并进行结果统计。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 GW501516对低氧诱导的PASMCs增殖与DNA合成的影响

与对照组相比，低氧刺激PASMCs 12、24、48 h后，其增殖与DNA合成显著增强(P<0.01)，不同浓度的GW501516(10、30、100 nmol/L)干预12、24、48 h后均能够抑制PASMCs增殖与DNA合成，且GW501516抑制增殖与DNA合成具有浓度依赖性(P<0.05或P<0.01，表1, 表2)

Tab. 1 Effects of GW501516 on the proliferation of hypoxia exposed PASMCs n=6)

Tab. 2 Effects of GW501516 on the DNA synthesis of hypoxia exposed PASMCs n=6)

2.2 低氧及GW501516对PASMCs内PPARδ的表达的影响

与对照组相比，GW501516(100 nmol/L)干预PASMCs 24 h能够显著上调PPARδ的表达[(1.00±0.15)比(2.48±0.21)](P<0.01)，而低氧可显著下调PPARδ的表达[(1.00±0.15)比(0.28±0.04)](P<0.01，图1 )。

Fig. 1 Effects of GW501516 and hypoxia on the expression of PPARδin PASMCs (n=6)

2.3 SC79逆转GW501516对低氧诱导PASMCs增殖与DAN合成的影响

与对照组相比，低氧刺激24 h能够明显促进PASMCs增殖与DNA合成(P<0.01)，GW501516(100 nmol/L)干预能够显著抑制低氧诱导的PASMCs增殖与DNA合成(P<0.01)，SC79可逆转GW501516对低氧诱导PASMCs增殖与DAN合成的抑制作用(P<0.01，表 3)。

Tab. 3 SC79 reversed the inhibition of cell proliferation and DNA synthesis by GW501516 in hypoxia stimulated PASMCs n=6)

2.4 SC79逆转GW501516对PASMCs细胞周期阻滞的影响

与对照组相比，低氧处理PASMCs 24 h后其分裂增强，处于G0/G1期的PASMCs比例明显减少(P<0.01)，而处于S期和G2/M期的PASMCs比例明显增多(P<0.01)，与低氧组相比，GW501516(100 nmol/L)干预后PASMCs分裂减弱，处于G0/G1期的PASMCs比例增加(P<0.05)，而处于S期和G2/M期的PASMCs比例显著减少(P<0.01)，而与GW501516低氧组相比，SC79能够逆转GW501516 阻滞细胞周期的作用(P<0.05或P<0.01，图 2，表4)。

Fig. 2 SC79 reversed the effect of GW501516 on cell cycle progression in hypoxia exposed PASMCs (n=6)

Tab. 4 Quantification of cell percentage in different phases (%, n=6 )

2.5 SC79逆转GW501516对Cyclin D1 mRNA的表达及p27 mRNA表达的影响作用

与对照组相比，低氧处理24 h后PASMCs内Cyclin D1 mRNA的表达明显增加，同时p27 mRNA的表达明显下降(P<0.01)；GW501516 (100 nmol/L)干预可显著抑制Cyclin D1的mRNA表达，同时促进p27 mRNA的表达(P<0.01)，而SC79能够逆转GW501516 上述作用(P<0.01，表 5)。

Tab. 5 SC79 reversed the effect of GW501516 on the mRNA expressions of cyclin D1 and p27，and the protein expressions of phosphorylated forms AKT and GSK3β in hypoxia stimulated PASMCs n=6)

2.6 SC79逆转GW501516对AKT/GSK3β信号通路的抑制作用

与对照组相比，低氧处理可显著促进PASMCs内磷酸化的AKT与GSK3β表达(P<0.01)，与低氧组相比，GW501516(100 nmol/L)可显著抑制酸化的AKT与GSK3β表达(P<0.01)，而SC79可逆转GW501516抑制酸化的AKT与GSK3β表达的作用(P<0.01，图 3 ,表5)。

Fig. 3 SC79 reversed the inactivating of AKT/GSK3β signaling pathway induced by GW501516 in hypoxia exposed PASMCs (n=6)

3 讨论

本研究发现，低氧能够下调PPARδ表达，PPARδ激动剂GW501516能够通过抑制cyclin D1表达以及促进p27的表达阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制低氧PASMCs增殖，同时GW501516能够抑制AKT/GSK3β信号通路，而SC79能够逆转GW501516 上述作用。

前列环素(prostacyclin, PGI2)是一种内生PPARδ激动剂，PGI2及其类似物在肺动脉高压治疗中已经取得显著进展[13]。然而有关PPARδ对低氧肺血管重构的作用及机制尚不十分清楚。PASMCs异常增殖在低氧肺血管重构中发挥关键作用，抑制低氧PASMCs增殖能够抑制低氧肺血管重构缓解HPH[14]。体外培养PASMCs，建立低氧PASMCs增殖的细胞模型，是探索HPH和肺血管重构发病机制的基础[15,16]。本研究通过体外建立低氧PASMCs增殖的细胞模型发现，低氧能够下调PASMCs中PPARδ表达，PPARδ激动剂GW501516能够上调PPARδ表达，并且GW501516抑制低氧诱导的PASMCs增殖具有浓度依赖性。DNA的合成量能够反映细胞增殖水平，本研究中BrdU试剂盒检测DNA合成的结果表明，GW501516抑制低氧PASMCs内DNA合成具有浓度依赖性。因此我们推测，低氧可通过抑制PPARδ表达促进PASMCs增殖细胞。在ox-LDL诱导VSMCs增殖实验中发现GW501516能够抑制VSMCs增殖，而通过RNA干扰或PPARδ抑制剂GSK0660抑制PPARδ的表达能够逆转GW501516抑制VSMCs增殖作用[7]。通过DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PAG)抑制内源性硫化氢诱导小鼠主动脉血管重构与VSMCs增殖模型中发现，PAG能够通过抑制PPARδ表达促进主动脉血管重构与VSMCs增殖，而GW501516能够抑制血管重构以及VSMCs增殖[17]。PPARδ激动剂GW0742药物涂层支架能够抑制血管内膜增生、支架术后再狭窄以及VSMCs增殖[18]。增殖受细胞周期调控，因此本研究检测GW501516对PASMCs细胞周期的影响。流式细胞仪的结果表明，GW501516可以阻滞G0/G1期细胞向S期过渡，从而抑制细胞周期进程。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2和CDK4/6与Cyclin E和Cyclin D1形成复合物后促进G0/G1期向S期转化，而细胞周期蛋白激酶抑制蛋白p27能够抑制该复合物活性抑制细胞周期进程[19,20]。本研究发现GW501516干预可抑制Cyclin D1的mRNA表达，同时促进p27 mRNA的表达。在PDGF诱导人PASMCs增殖细胞模型中，GW501516能够拮抗PDGF-BB促进Cyclin D1，抑制P27表达的作用[21]。

AKT又名PKB,主要介导细胞分化、增殖、凋亡、肥大、增生等多种生理及病理过程，AKT抑制剂AZD5363可抑制VSMCs的增殖[22]。GSK3β是AKT重要下游蛋白，其通过磷酸化失活，抑制AKT/GSK3β信号通路从而抑制PASMCs 增殖[23,24]。研究表明GSK3β调控cyclin D1从细胞核转运到细胞质，从而被蛋白酶水解，在白三烯 B4 (LTB4)诱导PASMCs增殖模型中发现通过siRNA抑制GSK3β表达可上调cyclin D1[23]。低氧能够通过活化AKT下调p27表达，诱导PASMCs增殖，而抑制AKT活化可上调p27的表达抑制低氧PASMCs增殖[25]。此外，抑制GSK3β活化可下调p27蛋白的表达[26]。本研究发现，GW501516可抑制低氧诱导AKT/GSK3β信号通路的活化。在VSMCs中过表达PPARδ能够抑制AKT磷酸化，PPARδ激动剂GW501516或GW0742能够抑制AKT磷酸化[6,27]。另外本研究还发现，AKT激动剂SC79可逆转GW501516抑制细胞增殖与DNA合成、阻滞细胞周期、调控Cyclin D1及p27的表达、抑制AKT/GSK3β信号通路活化等作用。因此推测GW501516通过抑制AKT/GSK3β信号通路抑制PASMCs的增殖。

综上所述，PPARδ激动剂GW501516能够通过抑制AKT/GSK3β信号通路抑制低氧诱导PASMCs增殖。GW501516有可能成为治疗和预防低氧肺血管重构相关疾病的新药物。本研究仅在细胞模型上研究GW501516对低氧PASMCs增殖的影响及机制，尚未在动物模型中验证GW501516对低氧肺血管重构的影响。因此后一步本研究组将在低氧诱导肺动脉高压大鼠模型上探讨GW501516对肺血管重构的影响。