细胞穿膜肽作为载体的研究进展

闫可心，闫宗斌，韩金成，张雪梅，薛书江，许应天

（延边大学农学院，吉林延吉133002）

细胞膜主要是由磷脂构成的半透性膜，具有选择透过性，分子质量不超过600 Da的物质才能透过细胞膜进入到细胞中，蛋白质、多肽和核酸等大分子物质不易进入细胞中且难以达到足够的浓度，故而为了实现跨膜的目的，需要运输载体的辅助。虽然显微注射、电穿孔及重组质粒等穿膜技术早已被普遍应用，但仍存在许多不足，比如转运效率不高、细胞毒性大[1]。近30年来，细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPPs）的发现为该领域提供了优良的输送载体，细胞穿膜肽也称为转运蛋白（membrane transduction peptides,MTPs）或蛋白质转导域（protein transductions,PTDs）等[1]，是一类富含碱性氨基酸，通常带有正电荷，pH近似中性，为包含5～30个氨基酸的小分子多肽。实验表明它能将多种物质如亲水性蛋白质、多肽、基因片段（RNA、DNA和反义寡聚核苷酸）和小分子药物等通过体内及体外的方式，在保证活性分子依然发挥作用的情况下导入到细胞内，而且不会产生免疫反应，某些CPPs甚至能够携带分子穿过血脑屏障、血睾屏障和胎盘屏障等重要的屏障系统发挥作用[2]。本文就其分类、在各领域中国内外研究现状进行综述。

1 CPPs的分类

CPPs的种类繁多，根据序列、功能、入胞机制和来源等特点，可以对其进行不同分类，依据CPPs的来源和理化性质进行分类比较普遍。

1.1 根据CPPs的来源

1.1.1 蛋白衍生物源自天然蛋白质多肽区域的蛋白衍生物，主要是转运蛋白质到细胞内[3]，没有细胞特异性，在不同温度（4～37℃）条件下有同样的运输效率。早在1988年，Green和Frankel已证实人免疫缺损病毒（HIV-1）的转录活化因子（TAT）能够穿膜进入细胞质和细胞核内[4]，HIV TAT蛋白具有细胞穿透功能的发现开启了细胞内药物递送的新纪元，这一发现对于克服细胞输送肽和蛋白质的挑战尤其重要[5]。TAT肽是TAT蛋白的短阳离子片段，迅速成为一种流行的研究工具，用于增强生物分子向细胞内的运输。蛋白衍生物含有大量的精氨酸和赖氨酸残基，且都带正电荷。

1.1.2 人工合成CPPs利用大部分CPPs带正电荷及赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸残基含量丰富的特点[6]，人工合成的多聚赖氨酸和多聚精氨酸同样具有穿膜入胞的能力[7]。目前许多具有穿透细胞能力的不同特性的人工新型CPPs在不断被开发。

1.1.3 嵌合肽嵌合肽由CPPs与药物通过共价连接的方式形成，为增强其靶向性，将CPPs和癌细胞核定位信号及细胞表层的多肽配体相结合，形成的嵌合肽可有较多功能。目前，应用频繁的多肽配体主要有RGD、YIGSR及NGR，由于其与癌细胞通过非特异性的方式识别而被广泛应用[8]。

1.2 根据CPPs的理化性质

1.2.1 阳离子型一般带有正电荷，含有碱性氨基酸，且其三维结构不呈现两亲性螺旋排布的CPPs归类为阳离子型CPPs。最具代表性的是TAT。在2000年，Mitchell研究了精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和组氨酸这几种碱性氨基酸的低聚物的穿膜能力，总结出精氨酸的低聚物较其他同链长的碱性氨基酸的低聚物有更高的穿膜效率[9]。有一些被称为核定位序列的阳离子型CPPs甚至更为特殊，它们可以通过核膜进入细胞核，但穿膜能力较弱[10]，将其与一段疏水的多肽共价连接，则可以获得穿膜效率较高的两亲性CPPs。

1.2.2 两亲性型两亲性型的CPPs一般具有极性基团和非极性基团，因此共同具备亲水性和疏水性。大多数的两亲性型CPPs含有偏多的正电荷，而其与阳离子型CPPs的主要不同在于入胞机制是由于两亲性而非正电基团[11]。

1.2.3 疏水型疏水型CPPs一般只含有非极性基团，具有较低的净电荷数。相比于前面提到的两种类型的CPPs，疏水型CPPs的报道相对较少，且其入胞机制尚不明确。

2 CPPs在各领域的应用

目前，CPPs的研究和应用是国内外学者关注的重点研究方向，尤其是CPPs在肿瘤治疗、新药开发、基因治疗和动物医学等方面应用较广泛。

2.1 肿瘤治疗领域

肿瘤特异性CPPs可以运载治疗药物靶向入胞，提高药物的渗透性，递送药物的过程可以得到有效地改善，且对正常组织无损伤[6]。两亲性型的p28是天青蛋白的28个氨基酸片段，作为晚期实体瘤患者p53（肿瘤抑制蛋白）泛素化的非HDM2介导的肽抑制剂，被用于对标准治疗有抗性的p53阳性中枢神经系统肿瘤患者，对难治性肿瘤有效，且患者耐受性良好[12]。多数的临床研究表明，CPPs与药物偶联后，具备了在肿瘤、神经性疾病等疾病治疗中的作用，TAT连接的p53蛋白以及R11连接的p53蛋白和血球凝集素HA-2，在小鼠模型经过腹腔注射淋巴瘤后，可促进肿瘤细胞凋亡且能延长小鼠的寿命[13]。作为一种肿瘤抑制机制，支架附着因子A（SAFA）衍生肽在调节多种SAFA分子功能、肿瘤细胞治疗等方面具有潜在应用价值[14]。此外，B-mR9对肿瘤具有特异性靶向作用，其EPR效应可持续48 h，B-mR9/siVEGF对NCI-H460的BALB/c鼠肿瘤生长的抑制率为56.5%，治疗效果优于PEI25k和R9载体[15]。李莉等[16]合成新型穿膜肽类似物[Cys-CPT2，9]penetratin，并证明[Cys-CPT2，9]penetratin是一个新的高膜转导活性的CPPs，且对HeLa细胞具有抗肿瘤活性。但是，当CPPs作用于体内时，仍存在血浆半衰期短、生物利用度低等问题，且其内化机制还不清楚，安全性也不能保证[17,18]。

2.2 药物递送领域

30年来，将药物活性分子运送到细胞内而对细胞正常生理功能不产生影响是一直以来人们的愿望，因此开始大量关注CPPs。CPPs在某些方向和领域的应用已经得到高度的肯定，研究成果也在逐步向临床应用方面转变[2]。自TAT被发现以来，CPPs作为载体运输生物大分子进入细胞的能力在体外实验中一直在被研发，TAT连接的-半乳糖苷酶能够向小鼠所有组织完成递送[19]。CPPs作为药物递送载体使药物进入细胞，甚至能穿透上皮细胞和血脑屏障，这一点已经被应用在许多疾病的治疗和新药的开发中。研究表明，将抗疟氨基喹啉与CPPs偶联可提供溶血偶联物，作为不同类型的小药物到生物大分子的载体具有较多优势，但由于溶血问题，CPPs似乎不适合抗疟药氨基喹啉的安全细胞内递送[20]。章卫华等[21]通过定量细胞摄取实验考察肺癌A549细胞对RGDD/TAT-LP的摄取效率，最后整合素受体RGD与TAT共修饰载紫杉醇（PTX）脂质体可以认定高表达整合素受体的肿瘤细胞，穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞，是一种潜在高效的肿瘤靶向给药系统。然而，CPPs对细胞的选择性不强，只借助其本身不能使药物形成定向蓄积，作用在靶细胞或者靶组织的药物浓度也达不到预期的效果，关于靶向载药CPPs的研究目前主要集中在肿瘤方面，其中基本的研究思路是利用不同“刺激-响应”策略来控制载药CPPs进入肿瘤细胞[22]。

2.3 基因治疗领域

在基因治疗时将外源基因导入靶细胞中是必不可少的过程[23]。目前，基因治疗临床受限于安全高效的基因载体，载体一般有病毒载体和非病毒载体两类，相比与病毒载体，非病毒载体更有优势[24]。聚精氨酸通常用于功能化纳米载体以进行基因治疗和药物递送，目的是增强治疗性物质的细胞渗透性。这些活性的相对权重由构建体的静电荷和纳米级材料的低聚状态决定，两者均可通过常规蛋白质工程方法调节纯化[25]。Sina Alizadeh等[26]采用HR9、Cady-2与CPPs复合形成稳定的纳米颗粒，并以非共价方式增强它们向HEK-293T细胞的递送，实验证明天然佐剂（Hsp27）和CPPs（HR9和Cady-2）的组合可以显著刺激有效的免疫反应，这对开发细胞的丙型肝炎病毒（HCV）治疗疫苗是比较有前途的方法。CD2v蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV）EP402R基因编码的跨膜蛋白，该蛋白含有重复的氨基酸序列（RAAS），研究表明带有RAAS截短的CD2v蛋白可以进入中国仓鼠卵巢细胞，还可以携带大分子蛋白EGFP通过依赖于时间、浓度和位置的多个内吞过程进入不同的细胞，RAAS为ASFV的研究提供了一个新的视角[27]。人工合成的新型穿膜肽也逐渐崭露头角，Simeon等[28]验证了一种基于HCV基因抑制元件筛选过程中发现的新型CPPs—B1，它不仅有效地介导细胞对大分子的摄取，还能将“货物”运送到与生物相关的细胞环境。马意龙[29]设计并合成了一系列基于氨氧赖氨酸的新型CPPs，研究了它的生物学性质，其结果说明一种基于氨氧赖氨酸的混合型CPPs，具有生物稳定性高和细胞毒性低的特点，并且可以在细胞浆中均匀分布。

2.4 动物医学领域

将外源DNA导入动物体内有多种方法，包括原核显微注射、电穿孔以及逆转录病毒阳离子分子介导的基因转移等，但这些技术的转染效率较低。近年来，由于CPPs毒性低，且它能够相对有效地将外源DNA运送到多种哺乳动物体细胞中，使得CPPs已成为一种有用的基因转染工具[30]。此外，CPPs也被用于将“货物”运送到微生物细胞，如多种念珠菌、真菌病原体等[31]。许多CPPs已经成功地将肽、寡核苷酸、蛋白质和载药纳米颗粒等分子运送至哺乳动物细胞群体[32]。HIV-1 Nef和Hsp20-Nef蛋白是在大肠杆菌表达系统中产生的，Rostami Bahareh等[33]使用新型CPPs-M918以非共价方式递送到HEK-293T哺乳动物细胞系中，实验表明，联合M918的蛋白细胞转染比仅用Nef或Hsp20-Nef蛋白的效率高，M918可以增加Nef和Hsp20-Nef蛋白对细胞的渗透。红色荧光蛋白与dsRED-9K融合在一起作为CPPs，提高了蛋白的传递，纯化的dsRED-9K能够有效穿透源自小鼠胚胎干细胞的所有细胞谱系[34]。通过共聚焦成像、流式细胞术和MTT法检测鸡贫血病毒（CAV）VP1蛋白（CVP1）的有效细胞穿透活性，研究发现CVP1肽可以有效地将蛋白质和核酸输送到细胞内[35]。CPPs与蛋白的联合作用提高了蛋白的跨膜效率。徐咏婷等[36]比较了两种常用穿膜肽TAT和R9的体外穿膜效率、对细胞影响以及小鼠活体内不同器官的穿膜效率，结果表明制备的两种融合蛋白TAT-EGFP和R9-EGFP均能实现有效穿膜，两种CPPs对细胞影响较小，且活体实验证明两种CPPs都能透过血脑屏障到达脑部。伏彭辉等[4]成功表达了融合蛋白EGFP（47.3 ku）和NLSEGFP-TAT（50.1 ku），纯化蛋白与水牛成纤维细胞共培养5～8 h后，EGFP蛋白不能进入细胞内，而NLSEGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的帮助下能够顺利进入细胞内，但未能显著定位到细胞核内。王立珍[37]报道TAT-Nb6融合蛋白被成功表达，该融合蛋白能够进入猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的细胞内，从而在细胞中起到抗病毒的作用，为抗PRRSV新型药物的研发开辟了新途径。

3 展望

总之，近年来大多数的CPPs被用于肿瘤治疗及药物递送，CPPs作为运输载体具有重要的意义。虽然关于CPPs的内化能力存在一些限制和不足，但它在许多疾病应用领域的价值已经得到关注和发掘，在临床实验中已经展现了良好的潜质，尤其在穿透血脑屏障以及上皮组织的转运治疗当中取得了巨大进展。可见CPPs在肿瘤治疗、医药学及基因治疗等领域具有良好的应用和发展前景。