外源添加氨基酸对郫县豆瓣模拟体系感官及特征风味的影响

孙文佳，王雪梅，李亚隆，王 瑶，周兴桃，车振明，刘 平

（西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039）

郫县豆瓣是以辣椒、蚕豆、面粉等为主要原料，经过长时间日晒夜露，利用微生物作用、酶促反应和美拉德反应，形成具有独特香气和滋味的发酵调味品。郫县豆瓣发酵过程中，原料中的营养物质在微生物催化作用下生成种类不同的代谢产物，代谢产物之间发生相互作用、多级转化[1]，如米曲霉分泌淀粉酶和蛋白酶，将淀粉与蛋白质分解成糖类与氨基酸，其中，部分糖类与氨基酸被空气中落入的酵母菌和细菌利用，生成乙醇、有机酸和酯类[2]，还有部分糖类与氨基酸在温度的作用下缓慢进行美拉德反应，产生醇、醛、酸、酯及杂环等复杂的风味物质[3]。

美拉德反应在食品热加工中产生独特的香气[4-6]、滋味[7-8]以及色泽[9]。选用不同的糖类与氨基酸，控制反应条件，可获得对应的美拉德反应产物[10]。凌萌乐[11]发现外源添加0.4%～0.6%的丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸可以显著促进普洱茶的渥堆发酵进程，缩短发酵周期。同时发现添加不同氨基酸能够形成独特的香味特征，如添加苯丙氨酸能形成明显的兰香，而添加丙氨酸和亮氨酸则能形成木香和陈香。近年来，传统发酵调味品酱油基于美拉德反应的风味调控也一直是研究热点。许瑜[12]对外加糖源的酱油进行感官评价和挥发性化合物定性定量分析，发现添加木糖使酱油中焦糖香、烟熏香、咸味显著增加，添加葡萄糖使麦芽香、土豆香、鲜味、酸味和甜味显著提高。冯云子[13]通过构建氨基酸反应模型，发现酱油中游离氨基酸和糖的代谢产物Strecker醛及α-二羰基化合物是特征风味形成的物质基础，与亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸等氨基酸密切相关。目前对郫县豆瓣风味的研究集中在特征风味物质的鉴定、还原糖组成和氨基酸组成上，而外源添加糖类或氨基酸对风味的影响尚未可知，对风味品质的提高及调控还未明确。

为进一步了解氨基酸对郫县豆瓣风味的影响，结合文献[13-23]中对氨基酸美拉德反应产物的报道，本实验综合选择11 种损失量较大的可能参与美拉德反应产生郫县豆瓣特征香气的氨基酸，即：谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、缬氨酸（Val）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）和甲硫氨酸（Met），利用豆瓣水提液提供的还原糖，建立氨基酸-豆瓣水提液美拉德反应模型，通过对氨基酸种类的筛选和添加量的探究，探讨氨基酸代谢与豆瓣关键香气化合物之间的联系，旨在为实现实际发酵体系中外源添加氨基酸等调控风味物质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹃城牌一级豆瓣 世纪百盛超市；Glu、Asp、Arg、Leu、Lys、Val、Ser、Phe、Ile、Gly和Me 源叶生物科技有限公司；邻二氯苯（纯度99%）、C8～C20正构烷烃 西格玛奥德里奇贸易有限公司；氢氧化钠、甲醛、丙酮、乙酸锌、亚铁氰化钾、葡萄糖（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

BPH-9082恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；QP2010 Plus气相色谱-质谱联用仪 日本岛津仪器公司；75 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；HWCL-3油浴锅 郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 郫县豆瓣水提液的制备

准确称量50 g郫县豆瓣于锥形瓶中，加入100 mL蒸馏水，用保鲜膜封口，于摇床中常温振荡提取8 h，然后在4 000 r/min离心15 min，上清液即豆瓣水提液。

1.3.2 单一氨基酸与豆瓣水提液美拉德反应

分别吸取20 mL郫县豆瓣水提液于11 个反应瓶中，分别加入1 g Glu、Asp、Arg、Leu、Lys、Val、Ser、Phe、Ile、Gly和Met，涡旋混匀，密闭后于90 ℃油浴中反应3 h后，立即用冰水冷却，装入EP管，于-4 ℃保存。同时用20 mL豆瓣水提液加热作对照。各美拉德反应产物依次表示为M-Glu～M-Met。

1.3.3 复合氨基酸与豆瓣水提液美拉德反应

1.3.3.1 氨基酸用量的探究

为明确氨基酸的适宜用量，以一级郫县豆瓣为研究对象，模拟豆瓣中Asp、Arg、Met、Leu、Phe与Lys的含量，以制作豆瓣水提液的稀释比例计算用量，将氨基酸按原有用量的1～5 倍进行设置，并依次编号为a～e组，如表1所示。准确吸取50 mL郫县豆瓣水提液于反应瓶中，每瓶分别加入混合氨基酸，涡旋混匀，于90 ℃油浴反应3 h后，冰水冷却，装入EP管，于-4 ℃保存，2 d内完成测定。对照组同1.3.2节，记为f组。a～f组的反应产物依次表示为M-a～M-f。

表1 氨基酸用量设计Table 1 Addition of low amino acid concentrations in Maillard reaction systems

1.3.3.2 氨基酸比例的探究

在预实验的基础上，将氨基酸的比例按表2设置，Asp、Phe和Lys为原来的2 倍，Leu、Arg和Met为原来的2～6 倍，并依次编号为A～E组。准确吸取50 mL郫县豆瓣水提液于反应瓶中，每瓶分别加入混合氨基酸，涡旋混匀，于90 ℃油浴3 h后，冰水冷却，装入EP管，于-4 ℃保存，2 d内完成测定。对照组同1.3.2节，记为F组。A～F组的反应产物依次表示为M-A～M-F。

表2 氨基酸比例设计Table 2 Addition of high amino acid concentrations in Maillard reaction systems

1.3.4 挥发性风味物质的测定

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法进行测定。准确吸取5 mL样液于顶空瓶中，加入10 μL邻二氯苯内标溶液（质量浓度为100 mg/L，溶剂为甲醇），混匀后置于55 ℃水浴平衡30 min，然后插入装有75 μm CAR/PDMS萃取头吸附40 min，进样，在GC进样口解吸5 min。

气相色谱条件：色谱柱采用Agilent HP-5石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度240 ℃；分流比为1∶2；总流量8 mL/min；升温程序：40 ℃保持1 min，以7 ℃/min升至150 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升至185 ℃，保持5 min，最后以10 ℃/min升至200 ℃。

质谱条件：电子电离温度和能量分别为200 ℃和70 eV；溶剂延迟时间1 min；质量扫描范围m/z35～500。

挥发性风味物质定性方法：将各组分的MS碎片模式与NIST17 Library谱库进行比对，选择相似性指数不低于80的组分进行初步定性，同时根据相同气相色谱条件下正构烷烃标准品的保留时间自动校正保留指数（retention index，RI），并与相关文献报道进行比对，进一步辅助定性。

挥发性风味物质定量方法：采用邻二氯苯作为内标物质进行定量分析，根据各组分与内标物质相应的色谱峰面积之比，计算被测组分的相对含量[24]。

1.3.5 感官评价方法

感官评价小组由6 名从事郫县豆瓣研究的人员组成（3 男3 女，24～27 岁），人员对郫县豆瓣的感官特征较为熟悉且敏感。感官评价方法、评分标准及计算公式参考Liu Ping等[25]的方法并稍作修改，从滋味（鲜味、咸味、酸味、甜味、苦味与辣味）和香味（香味度、持续性与协调性）等方面进行感官评价，总体得分经过加权处理，用“总分=0.45×香味得分+0.55×滋味得分”进行计算。取反应后的样液5 mL，加蒸馏水稀释到500 mL，进行感官评分，评定标准如表3所示。

表3 美拉德反应产物感官评价标准Table 3 Criteria for sensory evaluation of MRPs

1.4 数据处理

采用Excel 2016和Origin 9.0软件制作表格和绘图。

2 结果与分析

2.1 单一氨基酸对郫县豆瓣关键香气化合物风味的贡献

综合文献[24-31]对郫县豆瓣关键香气化合物的鉴定结果，得到26 种关键香气成分，分别为3-甲基-1-丁醇（异戊醇）、沉香醇（芳樟醇）、3-甲硫基丙醇、苯乙醇、壬醛、异戊醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、糠醛、苯甲醛、异戊酸、乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、壬酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、十六酸乙酯（棕榈酸乙酯、软脂酸乙酯）、β-月桂烯（月桂烯、香叶烯）、苯乙烯、吡啶、2,6-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯、4-乙基-2-甲氧基苯酚（4-乙基愈创木酚）和4-乙基苯酚。将单一氨基酸与豆瓣水提液进行美拉德反应后，对其产物中的挥发性风味物质进行分析，结果如表4所示。

由表4可知，Phe、Lys、Arg、Met、Leu、Gly、Glu、Ile、Asp、Val和Ser分别与豆瓣水提液进行美拉德反应后，得到17 种关键香气化合物。不同氨基酸对同一化合物的贡献有所不同，如加入Phe后，苯甲醛与苯乙醛含量分别增加了1 576.41 ng/g和2 443.05 ng/g，两者都具有花香，高玉珍等[15]将苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、苯乙醇归为苯丙氨酸类，认为它们与Phe代谢相关。许瑞红等[17]认为苯乙醛可能来自Phe的降解，由此推测，Phe与苯甲醛、苯乙醛的形成相关，且对两者贡献较大。同时也发现，加入Met后，美拉德反应产物中3-甲硫基丙醛增加了1 667.6 ng/g，且Met是3-甲硫基丙醛的唯一来源，与冯云子[13]认为3-甲硫基丙醛主要来源于Met的实验结论一致。徐欣如等[32]也指出，3-甲硫基丙醛是Met的Strecker降解醛，提供类似煮土豆的风味。Arg的添加使产物中芳樟醇含量增加了649.93 ng/g，芳樟醇广泛用于食品调香中，提供类似佛手的香味。Asp使多种关键香气化合物含量均有增加，而糠醛增量最大，为642.20 ng/g，与冯云子[13]研究结果相同的是，糠醛在多个氨基酸模型中都有产生，然而与对照样相比，只有Asp和Met能使糠醛含量增加，且Lys与Arg模型中未检测到糠醛，具体原因尚未可知。加入Lys后，2,5-二甲基吡嗪增加了319.00 ng/g，结果显示，Lys是2,5-二甲基吡嗪唯一来源，Huang等[14]发现2,5-二甲基吡嗪是Lys-葡萄糖体系中最丰富的生物碱之一，其可通过Strecker降解期间生成的α,β-胺基酮的自身缩合形成[16]。Leu对产物中异戊醛、芳樟醇的形成贡献较大，使两者分别增加了309.17 ng/g和288.74 ng/g，异戊醛是美拉德反应重要的降解产物，由Leu、Ile通过Strecker降解产生[18]。Gly、Glu、Ile、Val和Ser等氨基酸对郫县豆瓣关键香气化合物的贡献较小，且存在化合物消耗的现象，如：Gly对应的Δ6中有多个负值，包括芳樟醇、苯乙醇、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚和2,3,5,6-四甲基吡嗪，可能是因为添加Gly后，上述化合物发生某些反应，使其含量减少。因此，本实验选择Phe、Met、Arg、Asp、Lys与Leu 6 种氨基酸进行复合氨基酸模型构建。

表4 11 种单一氨基酸美拉德反应对郫县豆瓣关键香气化合物组成及含量的影响Table 4 Effects of 11 single amino acids on contents of key flavor substances in MRPs ng/g

2.2 复合氨基酸用量对郫县豆瓣风味的影响

2.2.1 复合氨基酸用量对郫县豆瓣感官特性分析

郫县豆瓣中的风味物质存在相互增强、相互抑制或相辅相成的情况，最终影响着郫县豆瓣的感官品质。对所选定的6 种氨基酸Phe、Met、Arg、Asp、Lys和Leu进行复配，并与豆瓣水提液进行美拉德反应，考察复合氨基酸用量对产物感官特性的影响，结果如图1所示。

由图1可以看出，在酸味、甜味与苦味等属性上，所有样品得分相当，说明氨基酸的用量并不影响这3 种属性的变化。在香味度属性上，除M-a外，均达到28 分以上，说明增加氨基酸用量会使豆瓣风味更加浓郁。与对照样M-f相比，所有组美拉德产物的持续性均有所提升，说明添加氨基酸能够使整体风味更加持久；但协调性有所下降，可能是因为目前是将所有氨基酸按原有比例同倍数增加用量，而不是对某一种或几种氨基酸的占比进行调整，由此导致某些氨基酸生成较多香气化合物，使得整体风味失调。将M-a～M-e进行比较，发现M-c的香味度、持续性、协调性、鲜味与咸味等属性得分均为最高，酸味、甜味与苦味等属性得分相当，同时，M-c的感官总分也最高。

图1 不同复合氨基酸用量制备的美拉德反应产物感官分析雷达图Fig.1 Radar map of sensory evaluation of MRPs prepared with mixed amino acids at low concentrations

2.2.2 复合氨基酸用量对郫县豆瓣风味物质影响分析

结合图2与表5可知，a～f组美拉德产物的挥发性风味物质数量在37～42 个范围内，绝大部分化合物在豆瓣中检出过，其中，除对照样M-f外，其余样品的关键香气化合物数量均为10 个，由此可见，各样品在化合物数量上无较大差异。将M-a～M-f按照挥发性风味物质含量多少进行排序，得到：M-e＞M-d＞M-a＞M-c＞M-b＞M-f，其中，关键香气化合物含量多少为：M-e＞M-d＞M-c＞M-a＞M-b＞M-f。在化合物含量上，M-d与M-e均高于M-c，但两者感官得分却比M-c低，特别是在协调性这一属性上，可能是因为M-d与M-e中，某一种或几种化合物含量过高，导致整体风味协调性不好。综上所述，故选用c组的氨基酸用量作为探究比例的初始用量，即：每50 mL豆瓣水提液中，加入0.700 g Asp、0.360 g Arg、0.050 g Met、0.370 g Leu、0.240 g Phe及0.250 g Lys。

图2 复合氨基酸用量对郫县豆瓣风味物质数量及含量的影响Fig.2 Effects of mixed amino acids at low concentrations on types and contents of flavor substances in MRPs

表5 复合氨基酸用量对郫县豆瓣风味物质组成的影响Table 5 Effects of mixed amino acids at low concentrations on contents of individual flavor substances in MRPs

将M-c与对照样M-f的关键香气化合物含量作差，可得到12 种关键香气化合物的变化情况，如图3所示。

图3 c组氨基酸用量对郫县豆瓣关键香气化合物的影响Fig.3 Contents of key flavor substances in MRPs derived from amino acid mixture c

从图3可以看出，M-c中的苯乙醇、异戊醛、糠醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚比对照样M-f中的含量多，其中，糠醛和苯乙醛分别达到184.23 ng/g和432.16 ng/g，另外6 种化合物的含量在0.45～39.29 ng/g之间。为保证每种关键香气化合物的含量均能增加，且尽可能地避免个别化合物含量较大，保证风味的协调统一，因此，对增加糠醛和苯乙醛含量的氨基酸占比进行缩小。

结合表4可知，能使糠醛含量增加的氨基酸为Met和Asp，且Asp使其增量巨大；能使苯乙醛含量增加的氨基酸为Phe和Asp，且Phe使其增量巨大，故考虑缩小Asp和Phe的占比。而异戊醇、芳樟醇、壬醛和2,3,5,6-四甲基吡嗪比对照样M-f中的含量少，说明在氨基酸进行美拉德反应时，这些物质发生了消耗，因此需要对增加这几种化合物含量的氨基酸增大占比，或对减少这几种化合物含量的氨基酸缩小占比。结合表4可知，能使异戊醇含量增加的氨基酸为Leu和Asp；除Asp外，其余氨基酸均能使芳樟醇含量增加；除Lys外，其余氨基酸均能使壬醛含量增加；未发现使2,3,5,6-四甲基吡嗪含量增加的氨基酸。吴建峰[33]发现四甲基吡嗪产生的主要途径为细菌代谢反应，也可通过3-羟基丁酮和氨的缩合作用合成，文献[22]报道的四甲基吡嗪是由美拉德反应和Strecker降解产生的氨基酮经缩合反应而成的结论吻合。故考虑缩小Lys的占比，增大Leu的占比。

综上所述，在探究氨基酸适宜比例时，将Asp、Phe与Lys占比缩小，Leu、Arg与Met占比增大，即：将Asp、Phe与Lys设置为原来的2 倍，Leu、Arg与Met设置为原来的2～6 倍。

2.3 复合氨基酸比例对郫县豆瓣风味的影响

2.3.1 复合氨基酸比例对郫县豆瓣感官特性分析

考察复合氨基酸比例对产物感官特性的影响，结果如图4所示。可以看出，M-A～M-F的咸味、酸味、甜味和苦味等属性得分相当，说明氨基酸比例的变化对这些属性无较大影响。在香味度、持续性、协调性及鲜味等属性上，M-A的得分均高于其余样品，且感官总分最高。

图4 不同复合氨基酸比例制备的美拉德反应产物感官分析雷达图Fig.4 Radar map of sensory evaluation of MRPs prepared with mixed amino acids at high concentrations

2.3.2 复合氨基酸比例对郫县豆瓣风味物质影响分析

续表6

续表6

结合图5和表6可知，6 组样品中检测到的挥发性风味物质数量为42～55 个，关键香气化合物数量10～12 个，同样，绝大部分化合物为豆瓣常见风味物质。挥发性风味物质含量与关键香气化合物含量的排序结果均为M-A＞M-B＞M-C＞M-D＞M-E＞M-F，其中，M-A的风味物质总含量为3 366.39 ng/g，关键香气化合物含量为2 114.41 ng/g。M-B的化合物数量最高，达54 种，M-A比其少了乙酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪这两种关键香气化合物，但M-A的感官总分最高，故这两种化合物没有影响样品的整体风味。由此可知，A组的氨基酸比例得到的产物风味协调且浓郁，即50 mL郫县豆瓣水提液中，加入1.400 g Asp、0.720 g Arg、0.100 g Met、0.740 g Leu、0.480 g Phe和0.500 g Lys。

图5 复合氨基酸比例对郫县豆瓣风味物质数量及含量的影响Fig.5 Effects of mixed amino acids at high concentrations on types and contents of flavor substances in MRPs

表6 复合氨基酸比例对郫县豆瓣风味物质组成的影响Table 6 Effects of mixed amino acids at high concentrations on contents of individual flavor substances in MRPs

3 结 论

本实验选取可能涉及通过美拉德反应形成郫县豆瓣风味的11 种氨基酸，构建氨基酸-豆瓣水提液美拉德反应模型，研究氨基酸代谢与郫县豆瓣风味形成之间的关系，结果发现：1）单一氨基酸-豆瓣水提液模型体系发现，6 种氨基酸使郫县豆瓣关键香气化合物含量显著增加，呈现如下对应关系：Phe→苯甲醛、苯乙醛、Met→3-甲硫基丙醛、Arg→芳樟醇、Asp→糠醛、Lys→2,5-二甲基吡嗪、Leu→异戊醛、芳樟醇。故选择Phe、Met、Arg、Asp、Lys和Leu进行复合氨基酸模型构建。2）复合氨基酸-豆瓣水提液模型体系发现，每50 mL郫县豆瓣水提液中，加入1.400 g Asp、0.720 g Arg、0.100 g Met、0.740 g Leu、0.480 g Phe和0.500 g Lys，使得郫县豆瓣关键香气化合物种类和含量更加丰富，感官更加协调且浓郁。