基于GC-IMS和化学计量学分析海鲈鱼肉蒸制过程中风味物质的变化

徐永霞，白旭婷，冯 媛，赵洪雷,*，李学鹏，励建荣，仪淑敏,*，谢 晶，郭晓华

（1.渤海大学食品科学与工程学院，渤海大学实验中心，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 锦州 121013；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276815）

海鲈鱼（Perca fluviatilis）学名为日本真鲈，属鲈形目，花鲈属，是我国沿海地区重要的经济鱼类之一[1]。海鲈鱼主要分布于太平洋西部，在我国以黄海和渤海产量居多[2]。海鲈鱼年产量大，据中国渔业年鉴最新统计，2019年我国鲈鱼养殖年产量约18万 t，比2018年增长了8.16%[3]。海鲈鱼的肉质细嫩鲜美，富含蛋白质和不饱和脂肪酸，且钙、镁、锌、硒、VA和B族维生素含量丰富，在市场上深受消费者的青睐[4]。

热处理是肉制品加工的重要方式，不仅可以提高食用安全性，而且可以赋予制品良好的风味和色泽[5]。热处理的方式和条件对肉品品质具有重要影响。常见的食品热处理方式包括蒸、煮、油炸和微波等，其中蒸制被认为是最健康的热加工方式，不仅可以较好地保留食材的营养成分和原有的风味特性，而且减少了油脂和盐的摄入，更符合现代人们的健康饮食需求[6]。随着生活水平的提高，人们对水产品的要求不再局限于营养价值，也越来越注重其风味品质[7-8]。目前，关于鱼肉挥发性风味物质的研究主要采用气相色谱-质谱联用法、全二维气相色谱-飞行时间质谱法、气相色谱-嗅闻法、电子鼻技术等[9-10]。气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技术是近年来新兴的一种快速检测挥发性风味物质的先进技术，能同时获得风味物质的构成及样品品质判别信息，具有灵敏度高、检测速度快、操作方便且样品分析温度低等特点，更能真实反映样品的风味存在状态[11]。此外，GC-IMS可对挥发性风味物质进行可视化表征，从而实现对不同样品的区分。目前GC-IMS技术已广泛应用于肉类、果蔬和酒类等食品中，在水产品中的应用相对较少，应用领域主要集中在关键香气[12]和异味化合物[13]的鉴定，食品的分级、溯源、品质评价[14-15]和质量控制[16]等方面。GC-IMS技术在食品风味领域中的研究逐渐增多，同时结合化学计量学方法也为该技术在食品风味分析中的应用提供了重要贡献。

本实验以海鲈鱼为研究对象，采用GC-IMS技术结合正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）、模型验证及热图分析等化学计量学方法，研究不同蒸制时间对海鲈鱼肉挥发性风味物质的影响，旨在为海鲈鱼的精深加工及食品化菜品的开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜海鲈鱼，每尾长（20±5）cm，尾质量约1 kg，购于辽宁锦州市林西街水产市场。

2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PL602-L电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；FlavourSpec®风味分析仪（配有LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析软件和GC×IMS Library Search定性软件） 德国G.A.S公司；Checkmate3顶空分析仪丹麦Densensor公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

取海鲈鱼背部肌肉，洗净沥干后切成大小均匀的鱼块，然后置于蒸锅内分别加热4、6、8、10 min和12 min，取出吸去鱼肉表面水分得到不同的蒸制样品（Z4、Z6、Z8、Z10和Z12）。以未经处理的新鲜鱼肉块为对照组（Z0）。

1.3.2 GC-IMS测定

自动进样条件：准确称取2.0 g样品置于20 mL顶空瓶中，设置孵育温度60 ℃，孵化转数500 r/min，孵育时间15 min，采用顶空自动进样的方式，进样量500 μL，进样针温度65 ℃，不分流模式进样。

GC条件：采用石英毛细管色谱柱FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），柱温60 ℃，载气为氮气（≥99.999%），载气的流速程序见表1，迁移管温度45 ℃，分析时间30 min，载气/漂移气为N2。

表1 GC检测条件Table 1 Gas chromatographic conditions

1.4 数据分析

采用Origin 2019b软件、SPSS 19.0软件进行数据处理及显著性分析，P＜0.05，差异显著。鱼肉样品中的挥发性成分采用仪器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）软件和Library Search软件进行采集和分析。利用LAV分析谱图并进行定量分析；通过Reporter和Gallery Plot插件对比指纹图谱的差异；利用Dynamic PCA插件对样品进行聚类分析，以确定未知样品的种类；应用Library Search软件内置的NIST和IMS数据库对挥发物进行定性分析。

2 结果与分析

2.1 海鲈鱼肉风味物质的定性分析

如图1所示，图中迁移时间1.0 ms处红色竖线表示反应离子峰（reactive ion peak，RIP），每个样品的迁移时间约为2.08 ms，各种风味物质的保留时间集中分布在100～380 s之间。RIP峰两侧的每个点反映了离子流的信号强度，代表一种挥发性物质，点的颜色及面积表示物质含量的大小，点的颜色越深、面积越大反映离子流的信号越强，物质浓度越高，反之越低[17]。从图1可直观看出，样品经蒸制处理后挥发性物质组成的差异，图中浅蓝色点和红色点的数量明显增加，且红色点的颜色逐渐加深，说明蒸制后样品的风味物质含量明显高于未经蒸制处理的样品。

图1 海鲈鱼肉蒸制过程中的特征风味二维GC-IMS谱图Fig.1 Two-dimensional GC-IMS spectra of characteristic flavor components in sea bass flesh during steaming process

为了进一步分析蒸制过程中海鲈鱼肉挥发性风味物质的变化，采用GC×IMS Library Search软件内置的NIST数据库和IMS数据库进行定性分析。依据挥发性物质的GC保留时间和离子迁移时间，以C4～C9的正酮类作为外标物计算每种挥发性物质的保留指数，通过与GCIMS数据库进行匹配，完成对鱼肉中挥发性物质的定性分析[18]。如表2所示，海鲈鱼蒸制过程中可明确定性的挥发性物质共有43 种，包括提高待分析物浓度时，出现2 个分子时共用一个质子或电子，形成二聚体的现象[19]。鉴定出的挥发性物质碳链普遍集中在C3～C9之间，包括醛类12 种、醇类8 种、酮类5 种、酸类2 种、酯类2 种和含硫化合物1 种，其中醛类物质的含量最高，其次是酮类和醇类物质。

表2 海鲈鱼肉蒸制过程中鉴定出的挥发性物质Table 2 Volatile compounds identified in sea bass flesh during steaming process

2.2 不同蒸制时间下海鲈鱼肉的风味变化

利用GC-IMS分析海鲈鱼肉蒸制过程中挥发性风味物质的变化，得到的风味指纹图谱如图2所示。指纹图谱中代表挥发性物质的点亮度发生明显变化，说明不同蒸制时间下鱼肉中挥发性风味物质的组成存在明显差异。经蒸制处理后，鱼肉样品中风味物质的含量明显高于对照组。随着蒸制时间的延长，鱼肉中挥发性风味物质的种类和浓度总体有不同程度的上升，这可能与鱼肉蒸制过程中发生的美拉德反应、脂类的氧化和裂解有关，此外一定的热处理可促进鱼肉中挥发性风味化合物的释放，从而增加鱼肉中挥发性物质的含量[20]。荣建华等[21]通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析蒸制对脆肉鲩鱼肉挥发性成分的影响，发现蒸制后鱼肉中挥发性物质的相对含量及种类均高于生鱼肉。

图2 海鲈鱼肉蒸制过程中的Gallery Plot图Fig.2 Gallery Plot analysis of volatile flavor compounds in sea bass flesh during steaming process

由图3可知，醛类物质在海鲈鱼肉中相对含量最高，其次是酮类和醇类物质。据研究报道，醛类化合物（C6～C9）主要来源于不饱和脂肪酸的氧化降解或氨基酸的斯特勒克降解反应，其气味阈值比较低，对鱼肉的整体风味影响较大[22-23]。和生鱼肉相比，蒸制处理显著增加了鱼肉中醛类物质的含量，且随着蒸制时间的延长，鱼肉中的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛和苯甲醛等醛类物质的含量逐渐增加。己醛和庚醛主要产生于亚油酸和花生四烯酸的氧化，辛醛和壬醛主要由油酸的氧化形成[24]；烯醛类主要来源于亚油酸和亚麻酸的降解[25]。其中己醛有青草气味，(E)-2-庚烯醛具有油脂香，对鱼肉风味均有重要贡献。酮类和醇类物质一般来源于脂肪酸的氧化降解，其气味阈值通常高于醛类，但具有独特的花香、水果香等令人愉悦的风味，可能对特殊鱼香味的形成有一定贡献。随着蒸制时间的延长，鱼肉中的1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-己醇、1-戊醇、1-丁醇、糠醇、3-呋喃甲醇、2-庚酮、2-戊酮和2-丁酮等醇类和酮类物质含量逐渐增加。1-辛烯-3-醇主要由亚油酸的氧化产生，具有典型的蘑菇味和清香，可增强鱼肉的脂香味[23]。酮类物质如2-庚酮、2-丁酮可通过脂肪氧化和美拉德反应产生，有研究报道，酮类对消减腥味有一定的贡献[25]。还有少部分物质在蒸制4 min或6 min时含量较高，如戊醛、丁醛和乙酸乙酯等。3-甲基丁醇、二甲基二硫、丙酸等物质在生鱼肉中检出的含量较高，而蒸制后含量逐渐降低。二甲基二硫化合物主要是由鱼体内含硫氨基酸降解产生，其气味阈值极低，在高浓度时具有刺激性气味，通常与变质的海味有关[26]。3-甲基丁醇和丙酸具有令人不愉快的气味，其在蒸制样品中的相对含量显著降低，说明蒸制处理可明显改善鱼肉的风味。

图3 海鲈鱼肉蒸制过程中挥发性组分的相对含量变化Fig.3 Changes in contents of volatile components in sea bass flesh during steaming process

2.3 OPLS-DA及热图聚类分析

2.3.1 样品的OPLS-DA

OPLS-DA为能够去除与X轴、Y轴有关的信号，建立物质表达量与样品类别间关系模型的有效判别分析统计方法[27]。利用OPLS-DA中的得分散点图对不同蒸制时间下鱼肉样品中的风味物质进行分析，结果如图4所示。随机改变分类变量的排列顺序建立相应的模型，RX2=0.966，RY2=0.879，当R2和Q2处于0.5～1之间时，表明模型有较好的概括解释率[28]：Q2=0.714，表示模型有较好的预测能力。当模型的稳定性和预测能力都比较好时，说明构建的模型稳定性及预测能力均达到要求，可用于区分不同蒸制时间下海鲈鱼肉挥发性风味组成的差异。

图4 海鲈鱼肉蒸制过程中的OPLS-DAFig.4 OPLS-DA plot of sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.2 模型验证

利用置换检验对OPLS-DA模型进行验证，根据样本数据的随机排列情况进行统计学推断[29]。它将样本进行顺序上的置换（n=200），重新得出统计检验量，构造经验分布，以此为基础进行推断。Q2代表累计交叉有效性，其值与模型预测能力呈正比；R2代表累计方差值，表示有多少原始数据被用来建立新的OPLS-DA模型，其值大则表示模型的解释能力强[30]。应用OPLS-DA模型进行拟合，其评价指标为RX2=0.966，RY2=0.879，Q2=0.714，说明所建模型拟合效果良好。为进一步验证模型是否过拟合，将部分样本的类别打乱，进行200 次的置换拟合。如图5所示，R2与纵轴相交（0，0.299），Q2与纵轴相交（0，-0.849），R2和Q2两条回归线斜率相对较大，左边随机排列产生的实验值R2和Q2均低于最右边的R2和Q2值，且Q2回归线的截距是负数，说明OPLS-DA模型均无拟合现象，预测能力很好，可直接用于样品的判别分析。

图5 海鲈鱼肉蒸制过程中OPLS-DA的拟合曲线Fig.5 Fitting curve of OPLS-DA for sea bass flesh samples with different steaming times

2.3.3 热图分析

通过热图和凝聚层级聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）法，将不同蒸制时间下的鱼肉样品与43 种挥发性化合物的关系进行可视化。依据OPLS-DA模型中的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）将每个变量对分类的贡献进行量化，其中VIP值大于1的挥发性化合物可作为潜在的特征标志物[31]。海鲈鱼肉蒸制过程中共筛选出11 种特征挥发性标志物（VIP＞1），包括醇类5 种、醛类4 种、酯类2 种。为了更加直接地区分不同蒸制处理下鱼肉特征挥发性化合物的变化，依据每种风味物质的峰强度值绘制热图，结果如图6所示。通过热图并结合HCA可以区分不同蒸制时间下海鲈鱼肉样品的风味差异，可将具有不同风味特征的鱼肉大致分为3 类，分别为生鱼肉（Z0）、蒸制4、6、8 min和10 min的鱼肉（Z4、Z6、Z8和Z10）以及蒸制12 min的鱼肉（Z12）。生鱼肉中挥发性标志物的种类较少，其中3-甲基丁醇在生鱼肉中含量最高，其含量随蒸制时间的延长而降低。Edirisinghe等[32]发现生鱼中的异戊醇含量随贮藏时间的延长而增加。因此，3-甲基丁醇可作为生鱼肉的特征性风味物质。蒸制12 min的鱼肉中1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛的含量最高，这3 种风味物质可作为鱼肉熟制后的特征性风味物质。

图6 海鲈鱼肉蒸制过程中特征风味物质的热图和HCAFig.6 Heatmap and HCA of characteristic flavor components in sea bass flesh samples with different steaming times

3 结 论

本研究采用GC-IMS技术对海鲈鱼肉蒸制过程中挥发性风味物质的变化进行分析，共鉴定出43 种挥发性物质，包括醛类、酮类、醇类、酸类、酯类和含硫化合物，其中醛类物质的相对含量最高，其次是酮类和醇类物质。不同蒸制时间下海鲈鱼肉的风味物质组成存在明显差异，其中新鲜海鲈鱼肉中3-甲基丁醇、二甲基二硫和丙酸等风味物质的相对含量较高，随蒸制时间延长，鱼肉中醛类、酮类和醇类物质的含量逐渐增加，如庚醛、辛醛、壬醛、3-甲基丁醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-辛二烯醛、苯甲醛、2-庚酮、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、1-庚醇、1-丁醇和3-呋喃甲醇等。采用OPLS-DA、热图聚类分析等计量学方法筛选出11 种挥发性标志物（VIP＞1），并能较好区分不同蒸制时间下的海鲈鱼肉样品，其中3-甲基丁醇、1-庚醇、糠醇和(E)-2-庚烯醛可作为生熟海鲈鱼肉的特征标志物。