穗发芽抗性相关分子标记在优质小麦中的有效性验证

李亚青，张 楠，彭义峰，张士昌，李孟军

（1. 石家庄市农林科学研究院，河北石家庄 050041；2. 河北省小麦工程技术研究中心，河北石家庄 050041）

小麦（Triticum aestivum）产量在世界粮食总产量中位居第一，是人类最重要的食物来源之一。我国是小麦种植大国，产量位居世界第一，是世界上最大的面食品生产国和消费国。在雨季和收获季重叠的地区，小麦收获前穗发芽是一个非常严重的问题[1]。小麦发生穗发芽后，籽粒内贮藏物质分解转化，影响其产量、加工品质和种用价值，从而造成严重的经济损失[2‑3]。因此，解析小麦穗发芽抗性分子机制，培育抗穗发芽小麦品种对于小麦生产具有重要意义。

目前，已经克隆了6 个与小麦穗发芽抗性相关的基因，包括Tamyb10、TaDFR（Dihydroflavone reductase）、TaVp-1（Viviparous‑1）、TaSdr（Seed dormancy）、TaPM19-A1（Plasma membrane 19‑A1）和TaMFT-3A（Mother of FT and TFL1‑3A）。这些穗发芽抗性相关基因可分为2 类：（1）种皮色泽相关基因，如Tamyb10、TaDFR；（2）参与脱落酸（ABA）信号转导或受ABA 诱导与调控的基因，如TaVp-1、TaSdr、TaPM19-A1、TaMFT。

R（Red grain color gene）基因控制的红色种皮与种皮型休眠有关[4‑5]。R基因定位在小麦第3 同源群长臂，与Vp-1基因相距约30 cM。Tamyb10是R基因的候选基因[6‑7]。DFR 是植物花色苷生物合成途径中的关键酶，DFR基因转录受R基因的调控，主要在红粒小麦未成熟种皮中表达[8]。TaDFR 和Tamyb10 均为MYB 转录因子[8‑10]。ABA 在调控种子休眠中发挥着非常重要的作用。许多与胚休眠有关的基因均参与ABA 合成和ABA 信号转导，如TaMFT、TaPHS1（Preharvest sprouting 1） 、TaCYP707A1（Cytochrome P450 707A1）和TaDOG1（Delay of germination 1）[3，11‑12]。TaVp-1是参与ABA信号转导的与胚休眠有关的转录因子，定位在小麦第3 同源群[13‑14]。在我国和欧洲小麦中，对TaVp-1B基因检测到6种等位变异[7，15‑17]；在不同小麦材料中，对TaVp-1A在第3 内含子中检测到6 种等位变异[18‑19]，在第3内含子、第5内含子和第6外显子检测到17 种等位变异[20]；但TaVp-1D中尚未发现等位变异[19‑20]。在小麦近缘种中克隆了11 种Vp-1单倍型[21]。水稻（Orazy sativa）OsSdr4基因是胚休眠特异调控因子基因，受OsVp-1基因调控。在水稻Osvp-1突变体中，OsSdr4表达下降，而发芽相关基因，如OsGA20ox1（Gibberellin 20 oxidase 1）、OsPIP（Plasma membrane intrinsic protein）和OsEXPB3（Expansin 3）表达显著升高[22‑23]。TaSdr定位在小麦第2 同源群，TaSdr-A1和TaSdr-B1中分别发现2 种等位变异，而TaSdr-D1中尚未发现多态性位点[24‑25]。TaPM19-A1编码ABA 诱导的膜蛋白19 基因家族蛋白，是胚休眠正向调控因子基因，其启动子区的18 bp 缺失导致其表达量降低，籽粒发芽指数升高[26]。MFT 是磷脂酰乙醇胺结合蛋白，分为FT-like（Flowering locus T‑like）、TFL1-like（Terminal flower 1‑like）和MFTlike 3 个亚家族[27‑28]。AtMFT通过直接抑制ABI5对ABA 信号途径进行负调控；AtMFT拮抗ABA 对种子发芽的抑制效应，促进种子萌发[29]。TaMFT抑制小麦籽粒萌发，是小麦3AS 染色体臂上控制种子休眠主效QTLQPhs.ocs3A.1的候选基因[30]。位于TaMFT启动子区域的 2 处 SNP（Single nucleotide polymorphism，-222 bp 和-194 bp）以及位于编码区的2 处SNP（+646 bp 和+666 bp）与穗发芽抗性和籽粒休眠显著相关[31‑33]。目前，尚未见对优质小麦穗发芽抗性相关基因分子标记有效性进行验证的系统研究。为此，利用优质小麦品种籽粒发芽指数，对穗发芽抗性相关基因分子标记的有效性进行分析，了解优质小麦抗穗发芽的分子机制，为抗穗发芽优质小麦品种的筛选及选育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试优质小麦品种42 份（表1），由国家小麦产业技术体系岗位科学家何明琦研究员提供。

表1 优质小麦品种信息Tab.1 The information of high-quality wheat varieties

1.2 穗发芽抗性基因分子标记检测

将42个优质小麦品种分别种植于营养钵中，每个品种选取3 株提取全基因组DNA。叶片总DNA提取采用植物基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。标记myb10D[34]、DFR-B[10]、Vp1B3[7]、Sdr2A[25]、Sdr2B[24]、PM19-A1[26]、MFT-3A[32]、MFT-A2[31]引物序列见表2，均在Invitrogen 公司合成，PCR扩增及PCR产物酶切分别参照文献[34，10，7，25，24，26，32，31]进行。PCR 反应在Biometra TGradient Thermoblock 上进行。PCR 扩增产物和酶切产物采用1.5%～2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色后观察记录。

表2 穗发芽抗性基因分子标记信息Tab.2 The primers information of pre-harvest sprouting resistance related genes

1.3 穗发芽指数测定

42 份优质小麦品种于2018—2020 年种植于石家庄市农林科学研究院院部试验地。小麦成熟后，采集无病害麦穗30 穗，自然干燥2 d，手工脱粒，于收获后7 d 测定籽粒发芽指数（GI）。发芽指数的测定参照文献[25]。籽粒先用体积分数为5% 的NaClO 消毒15 min，然后用去离子水冲洗。每个小麦品种取100 粒胚部完整的籽粒放于培养皿中（底部铺2层滤纸），3次重复，温度20～25 ℃，以胚部破白为发芽指标，统计每天的发芽籽粒数。发芽指数=（7×第1天的发芽籽粒数＋6×第2天的发芽籽粒数＋5×第3 天的发芽籽粒数＋4×第4 天的发芽籽粒数＋3×第5 天的发芽籽粒数＋2×第6 天的发芽籽粒数＋第7天的发芽籽粒数）/（7×总籽粒数）×100%。

1.4 数据分析

用Excel 2010 进行数据统计，用统计软件SPSS 16.0进行独立样本t检验分析。

2 结果与分析

2.1 myb10D标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

Tamyb10基因与红粒小麦穗发芽抗性有关，其中Tamyb10-D1对穗发芽抗性影响最大[35]。STS 标记myb10D 可扩增出2 种类型片段，能扩增出1 629 bp 片段的基因型为Tamyb10-D1b，不能扩增出1 629 bp 片段的基因型为Tamyb10-D1a。由图1A 和表3 可知，在42 个优质小麦品种中，5 个红粒品种基因型均为Tamyb10-D1b，发芽指数均值为13.7%；37个白粒品种基因型均为Tamyb10-D1a，发芽指数均值为46.0%。如果不区分红粒和白粒品种，2 种等位变异类型的籽粒发芽指数达到极显著差异（P=0.000）。 在优质小麦中，基因型为Tamyb10-D1b的红粒品种穗发芽抗性较强（发芽指数<30%），这5 个品种分别是龙麦20、龙麦26、龙麦35、龙麦40 和镇麦168。其中，镇麦168 是高抗穗发芽品种（发芽指数<10%）。以上结果表明，STS 标记myb10D能够用于红粒优质小麦品种的筛选。

图1 优质小麦穗发芽抗性相关基因等位变异检测Fig.1 Detection of allelic variations of pre-harvest sprouting resistance related genes in high-quality wheat

表3 优质小麦籽粒发芽指数Tab.3 Germination index of high-quality wheat seed

2.2 DFR-B标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

TaDFR-D无序列多态性，TaDFR-A的等位变异与穗发芽抗性无关；等位变异TaDFR-Bb在TaDFR-B启动子区有8 bp 插入，穗发芽抗性高于TaDFR-Ba、TaDFR-Bc[10]。CAPS 标记DFR-B 可扩增出2 种类型片段，分别是534 bp（TaDFR-Bb）和526 bp 片段（TaDFR-Ba或TaDFR-Bc），其中，534 bp片段经限制性内切酶Hinf Ⅰ酶切产生432 bp和102 bp片段。由图1B和表3可知，在42个优质小麦品种中，30个品种基因型为TaDFR-Bb，发芽指数均值为42.6%；12 个品种基因型为TaDFR-Ba或TaDFR-Bc，发芽指数均值为40.9%。无论是否区分红粒和白粒品种，2 种等位变异类型的籽粒发芽指数均无显著差异（P=0.377）。上述结果表明，在优质小麦品种中，CAPS 标记DFR-B 与穗发芽抗性无关联性，不能用于优质小麦抗穗发芽品种的筛选。

2.3 Vp1B3标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

TaVp-1 是参与ABA 信号转导的与胚胎型休眠有关的转录因子[13‑14]。TaVp-1D无等位变异，TaVp-1A等位变异类型多达17 种[20]。Vp1B3 是根据TaVp-1B第3 个内含子开发的STS 标记，已发现6 种等位变异，常见的有3 种，在抗穗发芽材料中为TaVp-1Bb（854 bp）和TaVp-1Bc（569 bp）基因型，而在穗发芽材料中为TaVp-1Ba（652 bp）基因型[7]。由图1C 和表3 可知，在42 个优质小麦品种中未发现TaVp-1Bb，仅有TaVp-1Bc和TaVp-1Ba。其中，27个品种为TaVp-1Bc基因型，发芽指数均值为44.5%；15 个品种为TaVp-1Ba基因型，发芽指数均值为37.8%。无论是否区分红粒和白粒品种，2种等位变异类型籽粒发芽指数均无显著差异（P=0.325）。表明STS标记Vp1B3不能用于优质小麦抗穗发芽品种的筛选。

2.4 Sdr2A和Sdr2B标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

TaSdr在小麦胚胎型休眠的调控过程中发挥着重要作用[25]。TaSdr-D1无等位变异。CAPS 标记Sdr2A 和Sdr2B 分别根据TaSdr-A1和TaSdr-B1的SNP位点开发。标记Sdr2A扩增出1 294 bp片段，经限制性内切酶PvuⅠ酶切产生1 146 bp 和148 bp 片段的为基因型TaSdr-A1a，产生618 bp、528 bp 和148 bp 片段的为基因型TaSdr-A1b；标记Sdr2B 扩增出826 bp 片段，经限制性内切酶PmlⅠ酶切产生650 bp、116 bp和60 bp片段的为基因型TaSdr-B1a，产生766 bp 和60 bp 片段的为基因型TaSdr-B1b。其中，等位变异TaSdr-A1a和TaSdr-B1a具有高穗发芽抗性[24‑25]。由图1D—E 和表3 可知，在42 个优质小麦品种中，TaSdr-A1和TaSdr-B1均有2 种等位变异。4个品种基因型为TaSdr-A1a，发芽指数均值为38.5%；38 个品种基因型为TaSdr-A1b，发芽指数均值为42.5%。21 个品种基因型为TaSdr-B1a，发芽指数均值为37.4%；21 个品种基因型为TaSdr-B1b，发芽指数均值为46.9%。优质小麦品种中，TaSdr-A1a和TaSdr-B1a基因型发芽指数分别低于TaSdr-A1b和TaSdr-B1b基因型，但无显著差异（PSdr2A=0.738；PSdr2B=0.144）。因此，CAPS 标记Sdr2A和Sdr2B 可用于优质小麦抗穗发芽品种筛选，但需要谨慎使用。

2.5 PM19-A1标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

TaPM19-A1 是小麦胚休眠正向调控因子。TaPM9-A1基因存在2 种等位变异类型，等位变异TaPM9-A1b启动子区18 bp 缺失导致其穗发芽抗性降低[26]。STS 标记PM19-A1 可扩增出2 种类型片段，分别为117 bp 片段（TaPM19-A1a）和99 bp 片段（TaPM19-A1b）。由图1F 和表3 可知，在42 个优质小麦品种中，仅3 个品种基因型为TaPM19-A1a，发芽指数均值为39.9%；39 个品种基因型为TaPM19-A1b，发芽指数均值为42.3%。2 种基因型籽粒的发芽指数无显著差异（P=0.849）。表明STS 标记PM19-A1不能用于优质小麦抗穗发芽品种的筛选。

2.6 MFT-3A和MFT-A2标记在优质小麦穗发芽抗性中的有效性分析

TaMFT基因具有抑制小麦籽粒萌发的作用。TaMFT基因的CAPS 标记MFT-3A 和STS 标记MFT-A2 分别根据其启动子区域的2 处SNP（-222 bp 和-194 bp）开发[31‑32]。CAPS 标记MFT-3A可扩增出800 bp 片段，限制性内切酶ClaⅠ酶切产生400 bp 片段的为CS（Chinese spring）类型，不能酶切的为Zen 类型。STS 标记MFT-A2 可扩增出148 bp 和115 bp 2 种类型片段，前者为TaMFT-A2a基因型，后者为TaMFT-A2b基因型。由图1G—H和表3 可知，在42 个优质小麦品种中，2 个品种为Zen类型，发芽指数均值为17.3%；40个品种为CS类型，发芽指数均值为43.4%。在42 个优质小麦品种中，33 个品种基因型为TaMFT-A2a，发芽指数均值为38.1%；9 个品种为TaMFT-A2b基因型，发芽指数均值为56.7%。在42 个优质小麦品种中，Zen 类型仅在白粒小麦中检测到，其发芽指数极显著低于CS类型（PMFT-3A=0.000）。无论是否区分红粒品种和白粒品种，TaMFT-A2a基因型发芽指数均极显著低于TaMFT-A2b基因型（PMFT-A2=0.007）。因此，标记MFT-3A 和MFT-A2 均适用于优质小麦抗穗发芽品种的筛选，TaMFT可能在优质小麦抗穗发芽机制中发挥着重要作用。

3 结论与讨论

随着全球气候变暖，小麦生育中后期面临越来越严重的高温威胁，导致种子休眠/穗发芽抗性水平下降，小麦收获前发生穗发芽的风险增大。小麦穗发芽抗性是多基因控制的数量性状，小麦种子休眠/穗发芽抗性相关基因的鉴定和功能标记的开发将有利于促进抗穗发芽优质小麦品种的培育。

Tamyb10基因与红粒小麦穗发芽抗性有关，其中Tamyb10-D1对穗发芽抗性影响最大[35]。本研究发现，在42 个优质小麦品种中，5 个红粒品种（龙麦20、龙麦26、龙麦35、龙麦40 和镇麦168 ）均为Tamyb10-D1b基因型，籽粒发芽指数证明其均为抗穗发芽品种，其余小麦品种基因型均为Tamyb10-D1a，2种等位变异类型的籽粒发芽指数差异达到极显著水平，说明myb10D 标记可用于红粒优质小麦的穗发芽抗性筛选，这与前人[34‑37]研究结果一致。在42个优质小麦品种中，无论是否区分红粒和白粒品种，CAPS 标记DFR-B 2 种等位变异的发芽指数均无显著差异。王渝等[38]分析了2 套白粒小麦的发芽指数与DFR-B标记的相关性，也发现两者无显著相关性。BI 等[10]研究发现，在120 个红粒小麦品种中，基因型TaDFR-Bb与穗发芽抗性达到极显著相关。在42 个优质小麦品种中，5 个红粒品种仅有2个（龙麦26、龙麦40）为TaDFR-Bb基因型。该结果与BI 等[10]不一致，可能与本研究中红粒优质小麦品种太少有关。杨燕等[36]和孙果忠等[39]研究结果表明，标记Vp1B3 与穗发芽抗性无相关性，与本研究结果一致[36,39]。曹雪连等[40]采用分子标记对1 015份小麦种质资源进行检测，发现标记PM19-A1与穗发芽抗性显著相关，与本研究结果相反。优质小麦品种的籽粒发芽指数与标记Sdr2A、Sdr2B 有相关性，但未达到显著水平，这与前人研究结果不一致[24‑25]。本研究中标记PM19-A1、Sdr2A 和Sdr2B 的结果与前人不一致，可能与本研究的样本量较小有关。本研究采用CAPS 标记MFT-3A 对优质小麦品种进行检测，发现仅郑麦366 和中麦14 为Zen 类型，发芽指数分别为13.1%和18.2%，与CS 类型小麦品种差异极显著。无论是否区分红粒和白粒品种，籽粒发芽指数与标记MFT-A2 均显著相关。CAPS 标记MFT-3A 和STS 标记MFT-A2 分别根据启动子区域2 个SNP（-222 和-194）开发，但二者等位基因类型与籽粒发芽指数的相关水平不同。表明根据同一基因（如TaMFT）核酸序列差异位点开发的标记，与目标性状的相关性可能存在差异，在分子标记辅助育种中应综合分析。

综上所述，STS标记myb10D可用于红粒优质小麦的穗发芽抗性筛选，CAPS 标记MFT-3A 和STS 标记MFT-A2 可用于白粒优质小麦的穗发芽抗性筛选。