浅谈影响ELISA试验结果的因素

秦万强

（贵州省务川仡佬族苗族自治县动物疫病预防监测中心，贵州 务川 564300）

1 ELISA实验室诊断方法概述

酶联免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种特殊的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫检测技术。ELISA是以免疫学反应为基础，根据抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的非放射性标记免疫检测技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，具有敏感性高和特异性强等优点。

2 试验结果的影响因素

2.1 试剂盒的选择

试剂盒的质量直接影响结果的准确性。目前市面上生产试剂盒的厂家较多，不同厂家的试剂敏感性、特异性不尽相同，导致检测结果就会有一定的差别，目前我们使用的试剂盒购自武汉科前有限公司、深圳康百得有限公司和深圳真瑞有限贵公司，不同试剂盒各有优缺点，但主要成分是相同的。

试剂盒使用前应恢复至室温(20～25℃)，摇匀、结晶溶解后方可使用，显色液不要暴露于强光和接触氧化剂，不同品种、不同批号的试剂盒组分不得混用，这是为了保证数据的准确性。不同试剂使用时应防止交叉污染，所有废弃物在丢弃之前应进行高压灭菌。

2.2 前期样品处理

首先是待检样品的预处理对检测结果有一定的影响，样品须血液凝固析出血清后进行血清分离，一部分血清未析出需用离心机进行血清分离，尽量取上清液，如果混浊会对检测结果造成一定的干扰；其次是溶血，溶血时红细胞破裂释放出具有过氧化物酶活性的物质，干扰试验结果，进而影响对结果的判断，因此对于采集来的全血需及时进行血清分离，发现溶血的样品应弃之不用，短期内（3天内）可将待检血清样品保存于2～8℃；若长期保存，应置于-20℃以下环境中，避免反复冻融；最后，就是保证待检样品有足够试验的用量，有些血清，尤其是鸡、牛血清在秋冬季节室外温度过低时容易出现凝胶状态，这样就无法吸取，应在试验前对待检样品进行适当的加热处理，以保证其融化。

2.3 移液器的使用

应使用准确性高的微量移液器且定期进行校准，对于使用时间过长取液不准确的移液器应及时淘汰，使用移液器时应注意加样的规范性，在吸取试剂或样品时应按在移液器的第一档，不能按在第二档，不然会造成吸取液体多而结果不准确，吸取待检样品时不可速度过快，以免将样品吸入移液器内，造成交叉污染，影响试验结果。试验完成后应及时将移液器调回量程范围内的最大值，并及时用酒精棉对整个移液器进行擦拭消毒。

2.4 加样与稀释

一部分试剂盒所需待检样品仅为5 uL，比如深圳康百得生产的羊小反刍试剂盒、猪口蹄疫试剂盒、鸡H5亚型抗体检测试剂盒等，多加或少加1 uL即有20%的误差，为了保证加样的准确性，需要将5 uL血清进行倍比稀释，即用样品稀释液对待检样品进行1：100倍的稀释，稀释好后再从中取100 uL待检样品进行试验，这样做一定程度上减少了误差。加样时应垂直将样本准确加入微孔底部，避免吸头碰到包被板的边缘，移液时尽量准确，慢吸快放，防止溅出或产生气泡，避免液体外溅残留在反应孔的上部。每次吸样需更换吸头，做到一样一吸头，避免交叉污染。加样品稀释液、酶标结合物、底物液、显色液及终止液时可采用多道移液器，迅速完成加液过程。

在稀释过程中，如果待检血清过多时，应先稀释完所有的待检血清，再加到抗原包被板上，使反应时间一致；另外，每个试剂盒都有相应的洗涤次数，需严格按照说明书进行操作，洗涤次数过多或偏少都会使检测结果出现严重偏差，洗涤时每孔需按操作加入等量的洗涤液，防止因洗涤不充分造成非特异性显色。

2.5 温度与时间的控制

温育是 ELISA至关重要的一步。只有在适宜的温度下抗体和抗原才能充分反应结合，每个试剂盒都有规定的温育温度，一般温育温度是37℃。不同的温育环境对检测结果有影响，在试验开始之前应提前将电热恒温箱开启，并按照试剂说明书上的要求设置好温育温度，以确保能在规定的温度下进行反应，同时不要反复开关恒温箱门，以免温度过低影响酶的反应，从而影响试验结果的准确性。除此之外，温育时间也是影响检测结果的一大因素，在ELISA检测中，要严格按照说明书的要求控制好温育时间[1]。

2.6 洗板

洗板是否合格直接影响检测结果的准确性。洗板分人工洗板和洗板机洗板，人工洗板人为主观因素影响较大，所以在用移液器加样时一定要保证移液器的准确性和减少人为的误差。使用洗板机洗板一定程度上可避免环境污染，提高工作效率。目前，务川县兽医实验室采用的是人工洗板方式。洗板时需要注意以下几点：一是洗涤液应严格按照操作说明进行稀释，不能将洗涤液溢出到孔外以免交叉污染；二是倒掉洗涤液应垂直甩板，不可斜着倒，洗板结束后将板拍干，应垂直将板扣在备好干净的吸水纸上，且注意每次拍板更换干净的吸水纸。

2.7 显色

显色底物分为A、B两种液体，加样时A、B液提前应恢复至室温，避免强光照射，按顺序依次加入不能颠倒，间隔最好不超过1 min，如先将两液混合再加样则需保证等体积混合。注意避光显色，显色是最后一步温育反应，酶将无色底物催化反应呈有色。显色的时间和温度均是影响结果的重要因素，一定时间内，阴性孔可保持无色，但阳性孔会随时间的延长而显色加强，显色时间不宜过短，因为一些低滴度抗体可能不会及时出现反应，造成假阴性结果；显色时间过长，对照值偏高或非特异性显色概率增加，因此显色时间一定要控制在说明书上规定的范围内。目前我们使用的 ELISA试剂盒显色温度一般为37℃或室温（20～25℃），显色温度不同，检测出来的结果就不相同，当温度过低时会导致结合反应速率变慢，显色不充分，造成低值阳性结果的漏检，所以操作过程中应严格控制温度。

2.8 波长设置及读数

读数时将酶标分析仪置于光源较好的地方，光源不充足不能及时读取试验数据，在设置波长时，应根据说明书最好设置双波长，通常为630 nm和450 nm。由于双波长可以消除同一块板上不同孔之间的差异，同时还可消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰，所以会减少试验数据的误差[2]。终止反应后的时间对OD值结果有明显影响，10～15 min阳性结果的OD值逐渐下降，阴性结果的OD值有所上升，所以必须严格按照说明书进行操作，最好在加入终止液后10 min内完成上机读数。

2.9 结果判定

在数据出来后，首先看阳性对照和阴性对照是否满足说明书上的要求，如果其中一项不满足条件，则证明试验不成立，需重新进行试验，如果都成立，再根据公式计算出试验结果。

3 其他因素

实验室的环境也是影响试验结果的一大因素，合理调控实验室的通风。实验室的温度及湿度可使用空调加以控制，湿度控制在60%左右，注意实验室的消毒及卫生清洁工作，避免对试验结果造成污染。在进行试验时先核对试剂盒是否在有效期范围，对于未使用完的试剂盒应及时放入2～8℃保鲜室内。另外要加强工作人员专业理论知识的学习，在工作中总结经验、不断积累，减少人为因素对试验结果的影响，提高检测的准确性，减少假阴性、假阳性结果的出现。