Runx2对骨骼生长发育的影响*

曹志威，申 杰，张司玺，张春阳

[1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 014010；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院神经外科；3.包头医学院神经外科疾病研究所(转化医学)；4.内蒙古自治区骨组织再生与损伤修复工程技术中心]

Runx2是Runx转录因子家族中的一员，其家族基因还有Runx1和Runx3。Runx2在软骨细胞、成骨细胞和多能间充质干细胞等多种形式的细胞中都有一定的表达[1]。有研究发现，在乳腺和胸腺中Runx2也有所表达。虽然Runx2不是T细胞发育所必需，但它是乳腺发育所必需[2]。P1和P2两个启动子对Runx2基因的转录起到调控作用。P1与P2转录过程中相对应的两种异构体，均能够在成骨细胞系和软骨细胞中表达，但Runx2在这些系中的表达受增强子的调控，其中大部分仍有待鉴定[3]。

1 Runx2在软骨细胞中的功能

Runx2在各时期的软骨细胞中都有表达，但在各个阶段表达量有所不同，前期增加，中期略有下降，终末期再次增加。Runx2实验鼠除胫骨、腓骨、尺骨、桡骨外，在其他骨骼中，都未找到肥大软骨细胞[4]。Runx3在早期肥大软骨细胞中，也有一定表达。Runx3基因敲除实验鼠软骨细胞的成熟在胚胎阶段存在相应的滞后性。Runx2与Runx3基因敲除实验鼠的全部骨骼，均未发现肥大软骨细胞。所以，Runx2和Runx3在软骨细胞的发育形成中扮演着重要角色。Runx2发挥关键功能，而Runx3发挥辅助性功能。在早期肥大软骨细胞中，Runx2影响Ihh的表达，进而加快软骨细胞的增殖速度[5]。另外，在一些实验中还观察到，Ihh影响甲状旁腺激素样激素(Pthlh)的生成，而后者抑制Runx2，从而延缓软骨细胞的成熟过程。Runx2-Ihh-Pthlh形成软骨细胞发展过程中的负反馈环[6]。

Runx2在软骨细胞中的过表达加速了整个软骨细胞的成熟，从而损害关节的形成。细胞黏合素(Tenascin)在永久软骨中表达，但在特异性的Runx2转基因实验小鼠中，其软骨内并未表达。在特异性阴性的Runx2转基因实验鼠中，Tenascin在全部骨骼环境下均有分布[7]。它对软骨细胞变成像生长板样的软骨细胞还是关节软骨样的永久性软骨细胞具有决定性作用。Runx2基因敲除实验鼠对骨关节炎的形成和发展，有明显的延缓作用，而软骨细胞特异性Runx2的不足推迟OA的变化，三苯氧胺诱导关节软骨中Runx2表达加速实验性OA小鼠的OA进展[8-9]。除Runx2表达外，Runx2调节的Ihh、Mmp13和Col10a1表达也增加[10]。导致骨性关节炎的一个原因是软骨细胞的成熟，而Runx2转录因子在其中起着关键作用。

2 Runx2在成骨细胞中的功能

Ihh基因敲除小鼠的实验中，在软骨中没有观察到成骨细胞的分布，软骨膜中出现的基因并未发现Runx2，说明软骨内骨必须要Ihh才能表达Runx2[11]。Ihh与受体Patched(Ptch)结合解除Ptch对Smoothened(Smo)的抑制，Smo最终调节转录因子Gli[12]。在使用Col2a1-Cre的Smo因素敲除实验鼠中，Cre在软骨细胞和包含成骨细胞前体的软骨膜细胞中都有一定的表达，相比之下Runx2在软骨膜中并未表达，不过在软骨膜外的细胞中，观察到Runx2的存在[13]。然而，指导成骨前细胞表达Cre的Sp7Cre缺失Smo并不影响成骨细胞的分化[14]。所以，Hedgehog信号路径调控Runx2表达与成骨细胞分化的作用，只是出现在软骨内骨发育的骨祖细胞阶段。

在使用Twist2Cre的条件性Ctnnb1基因敲除实验鼠中，未观察到成骨细胞的分布，但Runx2在软骨膜内表达[15]。所以，Wnt信号路径的功能实现，对成骨细胞分化过程十分关键，不过对Runx2在相应前体细胞中的表达，并非是不可或缺的。Sp7是成骨细胞分化所必需的另一种转录因子。Sp7基因敲除小鼠缺乏成骨细胞，但Runx2在骨祖细胞中表达[16]。Sp7在成骨前细胞和成骨细胞中都有表达，Runx2诱导Sp7表达[17]。因此，Runx2是Sp7的上游转录因子。在敲除Ctnnb1基因与SP7基因敲除的实验鼠中，骨祖细胞能够分化成软骨细胞。所以，表达Runx2的成骨细胞一直具有朝软骨细胞转化的性能，Wnt信号和Sp7影响骨祖细胞的分化，同时抑制其向软骨细胞的分化。

骨祖细胞和成骨前细胞弱表达I型胶原，这是一种异三聚体蛋白，由Col1a1和Col1a2分别编码的两条cyp1(I)链和一条cyp2(I)链组成。未成熟的成骨细胞上调Col1a1和Col1a2的表达，表达Spp1和Ibsp，成熟的成骨细胞表达有Bglap2和Bgap编码的骨钙素[18]。体外研究表明，Runx2上调这些基因的表达[19]。在Runx2基因敲除小鼠中缺乏成骨细胞系细胞表达这些基因。在丢失Runx2基因P1启动子和外显子I的Ⅱ型Runx2缺陷小鼠骨骼中，Spp1和Bglap2表达减少，但Col1a1表达增加[20]。成骨细胞中欠缺结构域丢失情况下，并不会造成骨骼表型的缺失，外显子8的不足将会形成隐藏的Runx2蛋白，后者保留DNA结合能力，而转录激活性能不足，造成骨骼质量变差[21]。由于隐蔽的Runx2蛋白可能干扰Runx3的结合，而Runx3也参与骨形成[22]。所以Runx2是怎样在机体内部调控相关蛋白基因的表达，后续还需要深入研究。

3 Runx2对成骨细胞系细胞增殖的调节功能

使用Prrx1启动子过表达Runx2导致颅缝早闭和肢体缺损[23]。肢体缺损的具体状态和转基因的表达情况相关。肢体经过成纤维细胞生长因子(Fgfs)与相应受体形成的上皮-间充质相互作用环发育[24]。间充质中表达的Fgf10通过对和Fgf10具有高亲和力的Fgfr2b诱导上皮中Fgf4和Fgf8的表达。Fgf4和Fgf8通过与Fgf4和Fgf8具有高亲和力的Fgfr1c和Fgfr2c诱导间充质细胞增殖。在Runx2过表达的小鼠中，Fgf4和Fgf8在上皮中的表达受损，顶端外胚层嵴(AER)的形成中断。这些表型是由间充质中与Fgf10有高亲和力的Fgfrs表达上调引起。Runx2通过直接调节Fgfr1、Fgfr2和Fgfr3的启动子来诱导它们的表达[25]。

Ctnnb1基因敲除小鼠和SP7基因敲除小鼠都缺乏成骨细胞，但在假定的骨区域有丰富的骨祖细胞。虽然Runx2基因敲除实验鼠同样缺乏成骨细胞，不过骨祖细胞只在特定的范围中有分布。在Sp7基因敲除小鼠体内的骨祖细胞表达Runx2并活跃增殖。Sp7基因敲除小鼠的胫骨和腓骨，因为内部骨祖细胞的充分积聚而弯曲，表明Runx2在骨祖细胞扩增中是必需的。事实上，Runx2诱导来源于野生型和SP7基因敲除小鼠的骨祖细胞的增殖，并增加Fgf2诱导的增殖。Fgfr2和Fgfr3参与增殖，Fgfr2在颅骨中的表达水平远高于Fgfr3，因此Fgfr2起主要作用。Sp7基因敲除Runx2基因敲除小鼠的骨祖细胞数量和增殖频率只有SP7基因敲除小鼠的一半，提示骨祖细胞的增殖依赖于Runx2的基因剂量。因此，骨祖细胞增殖需要Runx2，是通过直接调节Fgfr2和Fgfr3诱导的[26]。

一些报道表明，Runx2在体外能够抑制向成骨细胞系或间充质干细胞的增殖[26]。Runx2基因敲除颅骨细胞体外增殖快于野生型颅骨细胞。有研究显示，在Runx2基因敲除小鼠的培养中，细胞周期相关基因在颅骨组织和颅骨来源的细胞之间表达不同[25]。虽然Runx2基因敲除颅骨细胞在体外获得高增殖活性的原因尚不清楚，但Runx2在体内和体外都能促进成骨前体细胞的增殖。

4 Runx2在间充质细胞向成骨细胞分化中的作用

经过创建颅骨发育模型，可以较为理想地阐述间充质细胞向成骨细胞的分化过程和内在原理。Runx2基因敲除小鼠没有颅骨，只有一层薄薄的间充质细胞[27]。Runx2基因敲除小鼠出现颅骨发育，但过程延迟且缝合线未闭合。在实验鼠额后缝中，间充质在P7附近出现凝聚，间充质细胞逐渐完成分化，软骨细胞成熟，软骨由软骨内成骨替代[28]。

在Runx2基因敲除小鼠中，额后缝未见软骨细胞出现，并且所有缝线中的细胞密度都较低。在野生型和Runx2基因敲除小鼠中，缝合细胞同时表达Sox9和Runx2。Sox9在野生型和Runx2基因敲除小鼠中的表达水平相似。但是，Runx2基因敲除小鼠缝合细胞和成骨细胞中的Runx2-mRNA水平仅为野生型小鼠相应水平的一半。而在颅骨缝合细胞中Runx2-mRNA的表达水平只有成骨细胞的1/3～1/2。与野生型小鼠相比，Runx2基因敲除小鼠的缝合细胞增殖降低并且Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信号通路基因的表达降低。而且这些基因的表达直接受Runx2的调控。然而，与野生型小鼠相比，这些基因以及Sp7、Col1a1和Bglap2在Runx2基因敲除小鼠颅骨组织中的表达却没有降低。说明缝线间充质细胞的增殖及其向成骨细胞系细胞的转化，以及对hedgehog、Wnt、Fgf和Phhlh信号通路基因的诱导需要半数以上的Runx2剂量。然而，半剂量的Runx2足以使成骨细胞诱导这些信号通路基因Sp7和骨基质基因的表达。Hedgehog激动剂、Wnt3a、Fgf2和Pthlh(1-34)可促进颅骨形成，拮抗剂能够抑制骨形成以及缝合间充质细胞的生长。因此Runx2通过增加Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信号通路基因的表达来诱导缝合间充质细胞增殖并将其转化为成骨细胞系细胞。在这些信号通路中，Fgf信号通路可能在间充质细胞、骨祖细胞和成骨前细胞的增殖中起着最重要的作用[25，28]。

Hedgehog、Wnt、Fgf和Pthlh信号通路能够诱导Runx2表达或激活Runx2。成骨细胞系细胞的生长与分化受Runx2和这些信号通路的影响，虽然Runx2蛋白的激活等机制已取得较为丰富的成果，但Runx2基因在软骨细胞和成骨细胞系细胞中的转录调控仍有待研究。对Runx2、Sp7和Hedgehog、Wnt、Fgf、Pthlh信号通路之间相互作用的研究将进一步揭示骨骼发育的整个过程。