精子染色质扩散实验中精子晕环类型与精液参数的相关性研究

林垲皓 任枚琪 王联通 史潇

精子DNA损伤是指精子在生成及成熟过程中产生的单链和（或）双链的DNA 损伤［1］。研究证明，精子DNA 碎片指数（DNA fragmentation index，DFI） 与辅助生育后的妊娠率及流产率显著相关［2-3］，因此DFI被认为是评估男性生育能力的有效新指标［4］。检测DFI 的方法多种多样，其中精子染色质扩散实验（sperm chromatin dispersion test，SCD）检测技术简单、准确、重复性高、不需要特殊设备、价格便宜、结果判读容易，已被广泛应用于生殖男科学临床［1，5］。然而近年来有研究指出，SCD实验测出的DFI与妊娠结局相关性不高［6-7］，因而有学者开始质疑其应用价值。SCD不仅能够检测总的精子DNA 碎片率（即DFI），还可根据精子晕环大小细分出：大晕环精子，中晕环精子，小晕环精子，无晕环精子以及退化精子。精子晕环大小可以反映精子DNA 的损伤程度，精子晕环越大说明精子DNA受损伤程度越轻［8］，根据各类型晕环精子百分比可进一步对精子DNA损伤程度进行评估。有研究指出，与总DFI 相比，SCD 实验中的大晕环精子百分比对胚胎质量及妊娠的预测价值更高［9-10］。也有研究报道，反映精子DNA严重损伤和凋亡的无晕环及退化精子百分比较总DFI 更能有效地预测辅助生殖的妊娠结局［6］。然而目前SCD 细化分类与精液常规参数的相关性仍不明确，其临床意义的解读尚未完善。为此，本文对281 例男性SCD 结果及精液常规参数进行了回顾性分析，旨在探索两者之间的关系，为SCD细化解读提供依据。

资料与方法

一、研究对象

研究对象为2017年6月至2019年6月在南方医科大学南方医院生殖中心就诊行SCD及精液常规检查的281名男性。

二、精液常规分析

手淫法获取精液样本后，置于取精杯内37 ℃恒温保存。待精液完全液化并充分混匀后采用西班牙SCA 公司的计算机辅助精液常规分析（computerassisted sperm analysis，CASA）系统，依据世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》第5版检测标准，对患者精子浓度、前向运动精子百分比、非前向运动精子百分比、不动精子百分比等精液常规参数进行分析。精子形态学分析采用Diff-Quik法染色后，依据Strict标准进行分类。

三、SCD实验

SCD 检测原理为：在酸变性和去除核蛋白后，DNA 无损伤的精子染色质可扩散形成特征性的晕环，DNA受到损伤的精子则产生很小的晕环或无晕环产生［5］。本研究采用安徽安科生物的SCD 试剂盒对精子DNA损伤程度进行检测。简要步骤为：PBS缓冲液将精液标本浓度稀释至（5～10）× 106/mL；取60 μL 稀释后的精液标本与低熔点琼脂糖凝胶混匀，接着取10 μL 琼脂糖混合液滴到预处理过的载玻片上，盖上盖玻片；将玻片置于4 ℃冰箱中5 min，随后去掉盖玻片；并将载玻片放入盐酸中处理7 min，置于裂解液中处理25 min，双蒸水浸泡洗涤5 min，然后用75%、95%、100%乙醇各脱水2 min；空气干燥后，用瑞氏-吉姆萨染色15 min；双蒸水清洗后显微镜观察，每个标本多视野观察400 条精子，记录不同晕环类型的精子所占百分比。精子DNA 损伤程度按Fernández 标准［8］分为：①大晕环精子，即精子晕环直径≥精子核最大横径；②中晕环精子，即精子晕环介于大小晕环之间；③小晕环精子，即精子晕环直径≤精子核最大横径的1/3；④无晕环精子，即核外周无晕环的精子；⑤退化精子，即核外周无晕环且染色明显变浅的精子。总DFI 计算方法为（小晕环精子数+无晕环精子数+退化精子数）/计数精子总数。大、中、小、无晕环精子及退化精子百分比为各类型晕环的精子占总计数精子的百分比。

四、统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，描述统计资料用均值±标准差（mean±SD）、中位数（median）、第25 及75 百分位数（25thpercentile，75thpercentile）来表示。依据各类型晕环精子百分比及总DFI的中位数进行分组，小于和等于中位数者分为A组，大于中位数者分为B组。采用两独立样本t检验比较各类型晕环及DFI中A、B两组间精液常规参数的差异，P＜0.05提示差异有统计学意义。

结 果

一、研究对象的一般资料、精液参数及SCD结果

研究对象的基本状况、精液参数及SCD结果详见表1。研究对象的年龄平均为（36.0±5.9）岁；禁欲时间平均4.4天；精液PH平均为7.46；精液量平均为2.77 mL；精子浓度平均为52.89×/mL；前向运动精子百分率平均为37.61%，非前向运动精子百分率平均为11.64%，不动精子百分率平均为50.67%；精子正常形态百分率平均为3.20%。SCD结果中，大晕环、中晕环、小晕环、无晕环、退化精子百分比以及总DFI 的中位数依次为45.0%、42.5%、4.0%、3.0%、4.0%和12.0%。

表1 281名研究对象一般资料、精液参数及SCD结果

二、各类型晕环精子百分比及DFI 的A 组与B组间精液常规参数比较

各类型晕环精子百分比及DFI 的A 组与B 组间精液常规参数比较见表2。结果提示：大晕环A 组前向运动精子百分比显著低于B 组［（34.00±19.07）%vs（41.35±18.78）%，P= 0.001］，大晕环A 组不动精子百分比显著高于大晕环B 组［（54.72±20.75）%vs（46.46±20.83）%，P=0.001）］。而在中晕环、小晕环、无晕环、退化精子及DFI 的A 组与B 组间精液常规参数的差异均无统计学意义。

表2 不同晕环类型及DFI 的A组与B组间精液常规比较

讨 论

精子DNA是传递男性遗传信息的载体。然而在精子生成、成熟及转运过程中由于生殖细胞凋亡、染色质重塑及氧化应激等原因可产生DNA断裂，造成精子DNA 损伤。导致精子DNA 损伤的因素常常同时出现并互为因果。在精子生成过程中DNA需经历组蛋白组型转化，产生DNA缺口后染色质才能够获得重塑和浓缩，从而保证精子DNA的稳定性。若产生的DNA 缺口未能重新连接，将导致精子DNA断裂和（或）触发凋亡，造成精子DNA损伤［11］。若组蛋白组型转化过程异常，则将导致染色质浓缩不足，精子DNA 更易受到活性氧攻击而产生DNA 碎片［11］。另外，吸烟、饮酒、辐射、高龄、药物、环境污染物以及某些疾病（如感染、精索静脉曲张、糖尿病、癌症等）均可能通过诱导氧化应激、凋亡和染色质重塑障碍中一个或多个方面而导致精子DNA碎片的产生［11-12］。而精子DNA损伤程度的增加又会导致受精率、胚胎质量和妊娠率降低，并增加流产率［2-3，13］。

目前在检测精子DNA完整性的常用方法中，精子染色体结构分析（sperm chromatin structure assay，SCSA）是金标准［12，14］。它的优点在于灵敏度高，且具有固定、统一的阈值；缺点在于需要使用流式细胞仪，对实验室条件要求较高，费用昂贵，并不适合基层开展工作，因而限制了其临床推广。SCD法是目前检测精子DNA碎片操作最为简单、精确、重复性高和廉价的方法，无需配备昂贵的实验仪器。多项研究表明，SCD 和SCSA 的检测结果具有显著的相关性和一致性［15-17］。因此，SCD 法更适合基层医院进行临床推广。在既往的临床应用中，学者们大都关注于探索SCD 实验的总DFI 指标的临床意义。然而近期有研究指出，SCD 检测的总DFI 与妊娠结局无显著相关性［6-7］，而大晕环精子百分比对妊娠结局的预测价值更高［9-10］。也有研究报道，与总DFI 相比，无晕环和退化精子百分比也可能更为有效地预测辅助生殖的妊娠结局［6］。因此，逐渐有学者开始关注SCD检测结果中各类型晕环精子百分率在临床上的应用价值。但是目前SCD细化分类与精液常规参数的相关性仍不明确，其临床意义的解读尚未完善，故有必要对此进行深入研究。

本研究首次对男性精子SCD检测结果中各类型晕环精子百分比和精液常规数据之间的关系进行研究。统计发现：大晕环百分比大于中位数的男性前向运动精子百分比显著高于大晕环百分比小于和等于中位数者，而其不活动精子百分比显著低于大晕环百分比小于和等于中位数者。由于大晕环精子代表精子DNA 完整性最好的一类精子［8，10］，本文研究结果提示：大晕环精子百分比与精子运动能力关系密切，轻微的精子DNA损伤即可造成精子运动能力的显著下降。其机制可能与精子DNA损伤使线粒体呼吸代谢功能下降，进而导致精子鞭毛运动能力减弱有关［18］。此外，有研究指出精子DNA损伤的增加可反映活性氧类物质水平的升高［19］。由于精子膜含有高浓度的不饱和脂肪酸，极易受到氧化应激的损伤，引起精子膜脂质过氧化［20］，进而导致膜流动性和完整性下降、轴丝蛋白磷酸化水平降低，从而进一步引起精子活力下降［21］。另外，某些活性氧类物质（如H2O2）还可损伤酶活性（如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）并降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）在细胞内的利用率，导致细胞内抗氧化物质（如还原性谷胱甘肽）减少，进而加重精子膜磷脂过氧化［21-22］，从而加剧精子运动能力的损伤。而精液参数的异常可能由精子DNA损伤进一步影响导致，也可能是由某一致病因素导致，与DNA 碎片并无相关，精子DNA的完整性分析可以作为精液常规检测的补充。因此作者推测：大晕环精子百分比可能是反映精子DNA损伤的最敏感指标，其下降可能提示着精子氧化损伤的增加及线粒体呼吸代谢功能的下降，可进一步导致精子运动能力的降低。此外，由于精子运动能力与精子功能密切相关［23］，作者的研究结果也提示：精子DNA损伤检测可能能够反映精子的受精能力和胚胎发育情况。Tandara M 等［10］研究发现预测IVF 治疗后胚胎质量和妊娠结局时，大晕环精子百分比是比DFI 更好的预测参数，大晕环精子百分比越高妊娠率越高。说明精子DNA碎片程度可能与精子受精能力和胚胎发育有关。尽管Braude P等［24］指出，胚胎基因组只有在4～8细胞期才开始表达，因而卵母细胞在受精后原核形成和早期卵裂可能不受精子DNA完整性的影响。然而，若精子DNA 碎片过高，超过了卵母细胞修复精子DNA 损伤的能力，则可能会影响进一步的胚胎发育［25-27］。据此作者推测：大晕环精子所占比例越高，反映着精子质量越好，更容易实现受精、妊娠和胚胎顺利发育。

本研究中发现DFI 的A 组与B 组间的精液常规参数差异无统计学意义，表明DFI 的不同亚组间精液常规参数无显著差异。既往Sun TC 等［7］采用SCD检测精子DNA碎片，采用相关分析检测DFI与精液参数之间的关系，发现DFI 除与前向运动精子率呈显著负相关外，与其余精液参数无相关性。然而，另有不少学者相关分析的结果提示，DFI 与精子浓度、前向运动精子率、正常形态精子率存在显著负相关［6，15，28］。该结果与既往研究略有差异，可能是因为研究群体的差异、精液参数分析方法不同、分组和统计方式不同等因素造成的。尽管如此，在本研究中，DFI 与所有的精液常规参数无关，而代表精子DNA 完整性最好的大晕环精子百分比的降低与PR%的降低和IM%的增加有关，这提示与DFI 相比，大晕环精子百分比能更敏感地反映精子的运动效能。

综上，本研究首次对SCD检测结果中精子晕环大小对常规精液参数的影响进行了分析，深入探讨了细化SCD分类结果的应用价值，发现大晕环精子百分比较高的男性精子运动参数也更好。这说明大晕环精子百分比在一定程度上反映了精子的运动效能，轻微的精子DNA损伤均可导致精子运动能力的大幅下降。与精子总DFI 相比，SCD 细化分类更能够让临床医生了解患者精子DNA损伤的程度。因此各类晕环精子所占比值可能是比DFI 更有价值的评估参数，值得临床推广。