外泌体在原发性开角型青光眼中的研究进展△

张凤妍 谢潇杭 李远 张宇航

外泌体(exosomes)是一种直径小于150 nm的细胞外囊泡，由内体和多囊体(MVB)产生并释放至细胞外环境，是细胞外囊泡中最小的一种[1]。目前定义的外泌体是1983年在羊的网织红细胞中发现的。网织红细胞的成熟过程中转铁蛋白受体消失，在此过程中产生了外泌体[2-4]。外泌体主要是通过100 000 r·min-1的超速离心收集，但离心而来的沉淀内容物包含直径大于外泌体的细胞外囊泡[1,5]。外泌体含有多种多样的内容物，包括核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子等多种生物活性物质。最初外泌体被认为是细胞来源的无用代谢物[6]，目前研究表明,外泌体在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病及眼科疾病的发病机制、病理生理过程中发挥着重要的作用，同时可作为疾病诊断和治疗的潜在靶点。

原发性开角型青光眼(POAG)为常见的青光眼类型之一，其发病机制近年来仍未完全阐明。目前广为认同的机制包括机械学说、血管学说、跨筛板压力学说以及基因突变等遗传机制[7]，其共同之处在于致病过程中均涉及了小梁网(TM)、筛板细胞结构的改变及视神经的损伤。近年研究发现，外泌体及其相关蛋白广泛存在于房水与TM中[8]，基于其细胞间信号转导的功能，通过影响TM与房水通路参与了POAG的发病机制，并在诊断及治疗方面具有一定的潜力。本文就外泌体在POAG的发病机制、诊断及治疗中发挥的作用进行综述。

1 外泌体的形成与分离

外泌体即细胞外囊泡的分泌方式主要有两种，一种是直接由细胞膜而来，另外一种则是多囊体和细胞膜融合后再释放至细胞外[9-10]。外泌体主要储存于细胞内，释放入细胞外基质(ECM)中，通过体液作用于靶细胞进而发挥生物学功能。细胞内膜系统广泛参与到外泌体的形成以及释放过程中，多囊泡内体向细胞器内腔包裹内陷形成腔内小泡(ILV)[11]。在这其中，内吞体分选转运复合体(ESCRT)起到了关键作用。ESCRT最早定义为酵母中泛素依赖的蛋白质分选通路。ESCRT包括四种不同的复合体(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III)和相关蛋白质(包括VPS4VTA1和ALIX)[12]。多泡内体与细胞膜融合后进而将ILV作为外泌体释放出去。目前认为外泌体释放途径主要有ESCRT依赖型和ESCRT非依赖型，但是两者并不能完全区分开来[13-14]。先前提到在超速离心后得到的内容物中包含有比外泌体直径更大的细胞外囊泡，因此，如何提高外泌体的产量以及所获得外泌体的质量成为近期外泌体分离相关研究的关键。外泌体分离的方法主要有六种，分别为超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获技术、基于电中和的聚合物沉淀法、分子排阻色谱法以及微流控技术[15]。不同方法之间各有千秋。目前公认的外泌体分离的“金标准”仍然为超速离心法[16]。

2 外泌体参与POAG的发病机制

既往认为POAG的发生发展同房水循环障碍所致的高眼压相关，从而衍生出机械学说和血管学说[7]。作为POAG发病的主要危险因素，高眼压与房水流出阻力上升、ECM周转失衡密切相关。近年研究发现，外泌体作为细胞外囊泡可运输多种POAG相关细胞因子和蛋白参与房水循环，且在一项针对POAG患者TM组织的基因表达研究中发现，多种外泌体成分的基因表达与健康者存在差异，提示外泌体通路的异常可能参与了POAG的发生[17]。

2.1 外泌体参与运输POAG相关生物活性物质目前已有多项研究针对POAG患者的TM组织及房水样本进行了蛋白组学分析，其中有多项外泌体蛋白及外泌体相关的表达出现有统计学意义的变化，为了解POAG发病机制提供了新的思路。

MYOC是一种与POAG发病相关的基因[18]，3%～4%的POAG与其突变相关[19]。MYOC编码一种名为myocilin的分泌蛋白，早期认为myocilin的分泌方式遵从传统分泌模式，即经内质网和高尔基体的翻译后修饰。而Hardy等[20]于2005年发现，myocilin是经过一种与外泌体样囊泡相关联的分泌方式从TM释放，当多泡体与细胞质膜融合时，myocilin则与外泌体一起从培养的TM细胞中释放。myocilin在房水中含量丰富，参与细胞内外的蛋白水解过程[21]，并呈现出与外泌体相似的生化特征[22]，提示外泌体通过运输myocilin参与眼压的调节。Hoffman等[23]研究发现，在TM细胞内，myocilin相关外泌体的产生受皮质类固醇、钙离子载体和房水成分的调控，提示TM细胞通过释放myocilin相关外泌体来对环境信号作出应答。突变的myocilin被认为同POAG发病相关，一方面，TM过度产生或分泌myocilin可能会致其在TM内异常积聚，房水流出阻力增加，眼压升高[24]。另外，一项在大鼠POAG模型中的研究表明，突变的myocilin可诱导细胞凋亡，导致TM功能障碍，引发眼压升高[25]。 此外，也有研究通过检测POAG患者的TM基因表达，发现视神经病变诱导反应蛋白基因(OPTN)、WDR36等POAG相关致病基因表达的蛋白可能通过外泌体释放途径参与POAG 发生[17]。

部分细胞因子也可经外泌体释放途径参与POAG发生。TGF-β2为一种与 POAG有显著关联的细胞因子，有研究发现，50%的POAG患者的房水中TGF-β2表达上调[29]。TGF-β2可存在于外泌体当中，细胞外结构中含有TGF-β2的外泌体参与了POAG的发病过程。同时有研究表明，间充质干细胞(MSC)来源的外泌体中含有miR-27b，通过抑制TGF-β2信号通路参与到上皮间充质转换的过程中，因此猜想含有miRNA的外泌体通过影响TGF-β2的分泌进而调控眼压的稳定，参与POAG的发病过程[30]。

2.2 外泌体参与调控ECM周转POAG的主要特征为ECM在眼部血管及TM的病理性积聚和重塑，具体表现为，TM内的纤维连接蛋白(Fn)表达增加，ECM中的纤维和其他成分黏附于弹性纤维鞘，使纤维鞘衍生斑块的数量远超正常状态[31]。且斑块内皮下层的弹性纤维不规则增厚，多余的纤维组织黏着在TM网状组织，使房水的流出通道被阻塞，增加房水流出阻力，导致眼压升高[31]，引发POAG。

有研究显示，外泌体可通过侵袭性伪足结构及介导基质金属蛋白酶(MMPs)调节ECM的局部周转和重塑[32]。人TM细胞存在MMP-2和MMP-14共定位的区域(MMP-2是目前唯一确定的定位于TM的外泌体型蛋白[33])，呈侵袭性伪足样结构[34]，是一种具有高度活性的细胞器，含有丰富的MMPs，为局部ECM降解和重塑的位点。人TM细胞产生的外泌体可与Fn结合，与Fn结合后的外泌体可以在侵袭性伪足的细胞结构中调节ECM的局部周转与降解，维持房水的正常引流[32]，另外，包含MMPs的细胞外囊泡也可以直接参与ECM周转，使特化的细胞突起(侵袭性伪足)具有降解能力[8]。

Hoshino等[35]研究发现，外泌体的分泌活动对于侵袭性伪足的形成和功能发挥十分重要，纯化的外泌体可以诱导侵袭性伪足的形成，而侵袭性伪足的成熟和ECM的降解可能依赖于膜型基质金属蛋白酶1 (MT1-MMP) 和其他蛋白酶通过外泌体的传递，呈现正反馈回路。

外泌体同样可参与MMPs活性的调控，其携带的TGF-β2在进行TM组织培养时，可通过在组织中合成较多的转谷氨酰胺酶将蛋白质交联成不能被MMPs降解的复合物和抑制MMPs活化的纤维蛋白溶酶原激活剂抑制因子(PAI)[36]。PAI-1的增加会导致MMP-2活性降低，并可能导致患者TM的ECM增加[36]。

2.3 外泌体与小胶质细胞相互作用介导视神经损伤POAG的基础病理改变为视网膜神经节细胞(RGC)损伤，而炎症同视神经的损伤及青光眼的发生发展密切相关。近年来针对视神经退行性变的研究表明，小胶质细胞可参与POAG的发病机制。有研究发现，在POAG患者中，小胶质细胞的吞噬作用可促进RGC死亡[37]。小胶质细胞的外泌体与受体小胶质细胞可相互作用，Aires等[38]研究发现，在高静水压条件下，培养的小胶质细胞外泌体释放量增加一倍，且从中分离的外泌体可使受体小胶质细胞分泌IL-1β、TNF等促炎症反应细胞因子，并促进细胞的运动和吞噬功能，而在原代RGC培养中，小胶质细胞的外泌体也可诱导氧化应激与细胞死亡。以上研究提示，小胶质细胞间或存在一个由外泌体介导的细胞间通讯系统传播炎症反应信号，而外泌体介导神经节细胞死亡的机制目前尚不清楚。

3 外泌体与POAG的诊断

生物标志物被定义为在组织、细胞或液体等生物介质中可测量的生化、分子或细胞改变，代表正常或病理过程的指标，或对治疗干预的反应。外泌体中存在丰富的生物活性物质，并具有一定的耐寒性，近年来通过分离外泌体内组分从而获得生物标志物的研究不断增加。

在一项针对POAG患者的房水蛋白组学分析中发现，同健康者相比，POAG患者的房水中几种外泌体蛋白，如炎症蛋白(ELAM1)、调节脂质代谢的蛋白(Apo B和Apo E)、热休克蛋白(HSP60和HSP90)的表达显著升高[26,28]。明确这些外泌体相关生物标志物一方面反映了炎症、氧化应激等因素对疾病发生发展的影响，另一方面可为诊断POAG提供参考。

4 外泌体与POAG的治疗

青光视神经病变同视神经损伤类似，其特点为选择性死亡，不可逆性的退行性变。目前POAG中RGC死亡的机制仍不明确，而部分集中于细胞及通路的研究表明，其损伤或与免疫细胞募集、小胶质细胞的吞噬作用相关[37]。因而，当下针对青光眼，各类防治手段的最终目的便是减轻RGC的功能障碍，减少并预防视神经萎缩。如前文所述，外泌体可携带包括蛋白质、脂质在内的多种细胞活性物质，在细胞周转中发挥重要作用，因而具有潜在的治疗价值。

近年来，伴随着外泌体研究的不断深入，其在信号转导之外的作用也不断被发现。研究表明，间充质干细胞可分泌一种携带DNA、miRNA、蛋白质等成分的细胞外囊泡，其可以介导旁分泌，并具有强大的治疗潜力，这类基于MSC衍生的外泌体(MSC-Exos)治疗方法副作用较小，但也有研究表明治疗过程中有引起同种异体免疫应答的风险[39]。有研究者将骨髓MSC外泌体移植到三种不同的青光眼动物模型(激光光凝小鼠模型、微球前房注射小鼠模型和遗传DBA/2青光眼J小鼠模型)的玻璃体中，三种模型中骨髓MSC中外泌体均显著促进RGC的存活，同时防止其功能衰退，并对轴突有一定的保护作用，其作用机制是将外泌体相关mRNA转运入RGC内进行表达[40]。此外，外泌体在每月给药的情况下，疗效可长期维持。

5 总结与展望

外泌体目前已成为多学科研究的热点，近年来针对其与眼部疾病的相关研究不断增加。在POAG的发生发展中，外泌体可作为载体运输多种生物活性物质，并可经囊泡转运参与细胞通路间信号转导，其同小胶质细胞的相互作用介导了RGC损伤。外泌体在诊断和治疗领域具有较大潜能，但目前存在一定局限性。比如房水样本分析为有创检测，且所用的分析方法不能完全纯化外泌体，因而还不能将其应用于POAG的诊断；而针对受损RGC的MSC-Exos治疗方案尚未进入临床阶段，并且仅能依照功能细胞的表达来判断是否有效，并未探明具体的细胞靶点，未来仍需进一步研究及观察。