二代测序技术在外源性眼内炎患者病原微生物检测中的应用△

郝昕蕾 张依 李雪杰 金玮 杨安怀

眼内炎是一种严重威胁视力的眼部感染性疾病，及时准确识别致病微生物对于疾病的临床治疗和管理具有重要意义，病原体培养仍是目前诊断的金标准[1-2]。近年来，宏基因测序技术进展迅速，理论上可以在一次测定中无差别地检出临床样品中存在的所有病原体[1]，有助于疑难感染性眼病的早期诊断[3]。该技术不仅有望改善传统微生物的检测方法，还具有识别目前与眼内炎无关的新型微生物的潜力。本研究着眼于二代测序技术应用于眼内炎患者的可行性，并与传统的病原体培养技术对比，探讨其在临床中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料对2018年11月至2019年11月于武汉大学人民医院眼科中心就诊的21例21眼外源性眼内炎患者进行回顾性病例分析。其中男17例，女4例，年龄7～87(52.24±21.97)岁。左眼13例，右眼8例。其中，眼外伤后14例(66.67%)，超声乳化白内障吸除术后5例(23.81%)，后房型有晶状体眼人工晶状体植入术(ICL)后1例(4.76%)，经睫状体平坦部玻璃体切割术(PPV)后1例(4.76%)。所有患者入院时均已进行视力、眼压、裂隙灯显微镜、散瞳间接眼底镜检查，必要时行B超、眼前段照相、眼底照相等检查和全身必要的辅助检查等。纳入标准：(1)患者近期有眼外伤史或内眼手术史，确诊为外源性眼内炎；(2)眼内脓性样本进行二代测序检测和病原体培养两种方法；(3)同意手术治疗；(4)随访时间6个月以上。排除标准：(1)患者合并全身系统性疾病，诊断为内源性眼内炎；(2)眼内脓性样本仅进行二代测序检验或病原体培养任一种检测方法；(3)拒绝手术治疗；(4)随访时间不足6个月。本研究通过武汉大学人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署手术知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 手术方法患者入院时使用广谱抗生素进行全身治疗，根据病原学结果和药敏试验调整用药。局部用散瞳、抗感染滴眼液滴眼。入院后尽早手术，所有患者均进行玻璃体内注药[10 g·L-1万古霉素和(或)22.5 g·L-1头孢他啶]。除2例患者无PPV必要外，其余患者均进行PPV，术中尽可能清除前房及玻璃体内脓性病灶及炎性渗出。根据眼内感染及外伤情况决定异物取出方式、是否摘出白内障、取出人工晶状体、玻璃体内填充硅油或视网膜激光光凝。

1.2.2 眼内脓性样本采集方法在23 G微创玻璃体手术中，确保灌注液未进入玻璃体内的情况下，旋开切割器的管道螺旋帽，连接注射器，踩动脚踏板，抽取玻璃体内脓液；或直接用1 mL注射器进行前房穿刺抽取脓液[4]。前房标本2份，玻璃体标本19份，标本低温储存于EP管中。

1.2.3 二代测序方法收集眼内液样本(房水或玻璃体液)≥200 μL，无菌密封，于-20 ℃储存或干冰运输至实验室进行宏基因组二代测序检测。取样本200 μL参照天根DNA提取试剂盒(TIANGEN DNA Mini kit DP316，天根生化科技有限公司)说明书提取DNA并进行纯化。通过Qubit和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量。参照Qiagen的文库构建试剂盒(QIAseqTMUltralow Input Library Kit)操作手册进行DNA文库构建。将带有不同序列标签的合格DNA文库汇集在一起，采用Illumina Nextseq测序平台进行测序。获得测序数据后，通过过滤掉接头、低质量、低复杂度和较短的序列后生成高质量的数据。使用SNAP软件去除匹配到人类参考基因组的人源序列，然后使用Burrow-Wheeler Alignment算法将剩余数据与微生物基因组数据库进行比对。最后得到样品微生物组成。

1.2.4 视力评估方法利用Snellen或Feinbloom低视力表评估视力。将Snellen视力转化为logMAR视力。非Snellen视力记录如下：眼前数指规定为logMAR值为2.6，手动的logMAR值为2.7，光感的logMAR值为2.8，无光感的logMAR值为2.9。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0统计学软件进行数据描述与统计分析。数据以均数±标准差表示。对入院视力和末次随访视力差异做配对样本的非参数检验(Wilcoxon秩和检验)。对二代测序和病原体培养两种方法检出病原体阳性率的差异做卡方检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 患者临床特征21例患者临床特征见表1，均为单眼发病。18例有眼外伤史：金属所致眼外伤10例，木棍撞击伤2例，石头撞击伤1例,铅笔伤1例。眼外伤伴眼球内异物4例。7例有内眼手术史：白内障超声乳化吸除术后5例，ICL植入术后1例，PPV术后1例。患者就诊时间为0.1～30.0(4.84±6.81)d；除3例患者在10～30 d就诊外，其余均在1周内就诊。所有内眼手术后患者均以剧烈眼痛为主要症状就诊。本研究纳入的超声乳化白内障吸除术后眼内炎患者年龄均在65岁以上。

表1 眼内炎患者的临床特征及病原学结果

19例患者就诊时屈光介质混浊，间接眼底镜无法获取眼底特征，玻璃体内表现以术中所见为准。3例患者从眼外伤发生至我院就诊在2～6 h之内，其余患者前房和玻璃体内均有积脓或渗出。所有患者均定期玻璃体内注射万古霉素和(或)头孢他啶，19例患者行PPV，视病情决定具体手术方案。

2.2 眼内感染控制情况与视力变化21例患者中，1例患者的眼内感染未得到控制，行眼内容物摘出术，其余20例患者眼内感染均得到有效控制：眼痛等眼部刺激性症状消失，前房及玻璃体内感染灶消除，眼底得以窥见。

患者入院视力与末次随访视力见表1。通过Snellen或Feinbloom低视力表评估视力，其中视力改善11例，视力不变8例，视力下降1例(眼内容物摘出1例)。对患者入院视力和末次随访视力进行统计学分析(眼内容物摘出患者除外)，末次随访视力有明显提高(P=0.006)。

2.3 两种病原学方法检测结果与阳性率术中留取眼内脓性标本进行二代测序和病原体培养两种检测方法，结果见表1。二代测序检测病原体阳性率为95.24%(20/21)，病原体培养阳性率为42.86%(9/21)，二者之间差异有统计学意义(χ2=13.480，P<0.001)。病原体培养阳性的9例标本均培养出单种病原体；二代测序检测病原体阳性测序的20例标本中，13例标本检出单种病原体，7例标本检出两种病原体。在培养阳性的标本中，其中8例(8/9,88.89%)与二代测序结果具有一致性，另一例利用二代测序检出两种病原体。

3 讨论

眼内炎是一种短时间内导致视力不可逆性丧失的感染性眼病，包括外源性与内源性两大类，以前者多见，根据危险因素不同，分为3类：内眼手术后、眼外伤后、角膜感染相关眼病[2,5]。通过患者眼部表现及眼外伤或内眼手术史，做出眼内炎的临床诊断，玻璃体液或房水培养结果支撑诊断，培养阴性不排除眼内炎可能[2]。

外源性眼内炎病情发展快，短时间内迅速恶化，多可观察到眼内脓性病灶，本研究纳入对象除3例眼外伤患者在6 h内就诊(见表1)，初诊时前房清亮，其余患者均有前房炎症反应。相较于内源性眼内炎患者就诊时间在数日至数个月不等，外源性眼内炎患者多在1周内就诊。本研究中仅一例老年男性患者在右眼被铁钉扎伤30 d后因眼部剧痛于我院就诊，术后眼部及全身炎症反应重，在患者本人及家属要求下，行眼内容物摘出术。其余患者眼部感染均得到有效控制，保留眼球，提示及早就诊，有利于控制眼部感染，挽救视力。

以往研究报道，病原体培养的阳性率为40%～70%[5-7]，部分眼内感染无法明确病原微生物种类。二代测序技术具有无偏倚、覆盖广、快速等特点[7-8]。文献指出，宏基因组测序与病原体培养、16S PCR在感染性眼内炎病原体检测中具有较高的一致性、敏感性和特异性，前者可在部分培养或PCR阴性的标本中检出病原体[5,9]。有学者在16例感染性角膜炎患者和4名对照组受检者中发现18例样本存在病原微生物感染[10]，测序技术发现病原体的敏感性高[6]。本研究中，二代测序阳性率为95.24%，显著高于病原体培养阳性率。

宏基因组测序技术检测范围扩大，可以检出多种病原体，对多重感染的发现具有积极意义[5,9-11]；在明确少见病原体致病方面亦有重要价值，能发现传统手段无法鉴定的病原体[5,7,12]，有学者利用测序技术发现2例猪疱疹病毒导致的人类眼部感染[13-14]。本研究中病原体培养均为单一病原微生物，二代测序发现7例多重感染，均检出两种菌类。在测序覆盖度足够高的情况下，阴性结果有助于排除发生感染性疾病的可能[8,15]。本研究测序结果多为细菌单一或混合感染，病例16和18除外，结合临床表现与检出序列数，认为前者为单一真菌感染，后者为细菌和真菌混合感染，加用玻璃体内注射抗真菌药物(迪尔达宁)治疗。传统病原体培养耗时长，尤其对真菌而言，大多数真菌生长需要48～72 h，有时需2～4周产生孢子[16]。宏基因组测序周转时间根据平台而有所差异[16]，平均为48 h[8]，能较早得知病原微生物结果，及时调整用药。

宏基因组测序技术局限性在于污染导致的假阳性，污染来源于试剂或环境中检测到的背景微生物和人体正常菌群，生物信息分析或数据库错误等[15,17]。病例6为内眼手术后患者，测序检出戈登链球菌和伯克菌科两类细菌，但后者致病性和流行病学尚未完全明确，暂不考虑其为真实致病菌。临床医生及微生物学者习惯了传统培养简单输出的二元结果，通常以检出与未检出进行区分[7]，测序技术的假阳性要求医生在采集样本时遵守无菌原则，结合患者临床特征和病原菌流行病学正确解读报告，避免滥用抗微生物药物。

宏基因组测序技术的另一缺陷是缺乏药敏结果。尽管二代测序技术能较早检出病原体，及时调整抗生素，但抗生素滥用导致细菌耐药形势严峻，缺乏药敏结果仍无法实施精准治疗。目前已有文献指出，宏基因组测序可以检测毒力基因和耐药基因，预测耐药表型[7,9,15,17]。Doan等[9]对7例眼部感染巨细胞病毒的样本进行宏基因测序分析，并与斯坦福大学开发的抗巨细胞病毒药物耐药性数据库进行比较，发现3例具有更昔洛韦和缬更昔洛韦耐药性突变。

本研究也有其局限性:(1)研究对象具有选择偏倚，部分患者如角膜溃疡感染灶少，样本量不足,无法同时进行两种检测手段，或部分家庭无法承担手术或检测费用等；(2)测序结果未经荧光定量PCR验证；(3)部分测序数据缺失，未对序列数、覆盖度等进行定量分析，结果存在假阳性可能。

本研究证实，二代测序可以发现临床诊断为外源性眼内炎但病原体培养为阴性的病原微生物。作为一种新兴技术，可以与传统的培养手段结合使用，共同指导临床诊治。临床医生应合理使用该技术，避免滥用，正确解读报告结果，在精准医疗的道路上也需考虑经济医疗，减轻患者经济负担。