绿鳍马面鲀烂嘴症致病菌的分离鉴定及药敏试验

英娜 王元 唐成婷 秦搏 杨立国 宋学锋 郝志军 高建民 吴艳庆

(1中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2平邑县农业农村局，山东临沂 273300；3烟台海关技术中心，山东烟台 264000)

绿鳍马面鲀(Thamnaconusmodestus)隶属于鲀形目(Tetraodontiformes)、单角鲀科(Monacanthidae)、马面鲀属(Thamnaconus)，又称扒皮鱼、耗儿鱼等[1-2]。因其肉质鲜美，富含人体必需氨基酸及不饱和脂肪酸[3]而深受消费者的喜爱。近年来，随着捕捞生产的加剧，野生绿鳍马面鲀的资源量急剧下降。为了满足市场需求，国内多地开展了绿鳍马面鲀工厂化养殖。尤其2011年人工繁育技术突破以后[4]，绿鳍马面鲀工厂化养殖产量越来越高。然而对于水产动物而言，养殖密度的加大也意味着患病风险的增加。

2019年夏季，江苏连云港地区某养殖场发现有部分养殖绿鳍马面鲀因嘴部皮肤溃烂、影响进食而死亡。镜检病灶及鳃、鳍部未发现寄生虫，但是从病灶处分离出大量单一性状的菌落。为确定病灶优势菌的菌种信息，探明此菌与养殖绿鳍马面鲀发病的关系，本研究进行了细菌分离鉴定工作，并针对此菌株开展了相关的药敏试验，以期为该病的治疗及预防提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用绿鳍马面鲀来自江苏连云港某养殖场，为15个月龄鱼。挑选典型的具有烂嘴、鱼体偏瘦、体色发黑症状的濒死鱼作为试验材料(见图1)。Luria-Bertani培养基(LB培养基)、TCBS弧菌选择性培养基购于青岛海博生物有限公司；革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；DNA提取试剂盒、2×TaqPCR Mix 预混液购于生工生物工程(上海)股份有限公司；药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司。

图1 健康(a)与发病(b)绿鳍马面鲀的嘴部Fig.1 The healthy(a)and diseased(b) mouth of T. modestus

1.2 组织处理和病原菌的纯化

取濒死病鱼的嘴部溃烂组织，镜检观察是否有寄生虫。用75%酒精对溃烂组织进行表面消毒处理后，采用灭菌纸巾吸干表面水分。将以上组织剪碎、匀浆、稀释处理，吸取100 μL匀浆稀释液接种于直径为90 mm的LB固体培养基上，置于28 ℃培养箱恒温培养20 h后，将优势菌落再次划线分离培养，蘸取少量纯化菌于载玻片上，经革兰氏染色后进行显微镜观察。

1.3 病原菌分子鉴定及序列分析

将再纯化的菌落接种到LB液体培养基中，摇菌16～20 h(恒温摇床：28 ℃，150 r/min)。并将一部分菌液加入甘油冻存留种，另一部分菌液离心清洗后，按照DNA提取试剂盒说明书的流程进行基因组DNA的提取。使用16S rRNA基因通用引物进行PCR核酸扩增，通用引物序列为：27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR反应体系为25 μL(包括1 μL DNA 模板，12.5 μL 2×TaqPCR Mix，10.5 μL ddH2O，上、下游引物各0.5 μL)。反应条件为：94 ℃预变性5 min，然后进行35个循环的扩增程序(94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s)，最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳鉴定。将扩增出目标条带(1 500 bp左右)的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)，并进行BLAST(basic local alignment search tool)比较，选取比对结果中相似性排名前10的序列作为待测菌株参考，通过邻接法(neighbour-joining，NJ)构建目标菌株与相似性序列的系统进化树。

1.4 人工回感试验

选择健康绿鳍马面鲀(15个月龄左右，体长8.2～10.4 cm)为感染对象。将甘油冷冻保存的目标菌株进行LB液体培养基活化培养，并制备一系列浓度梯度稀释的菌悬液，注射到健康鱼体内，注射量为200 μL/尾，并以同样体积的生理盐水作为对照组注射液。注射后的绿鳍马面鲀分别饲养于流水(日换水量为200%)、充气的玻璃钢鱼缸内，水温约为18 ℃。1周后统计试验用鱼的症状率和死亡率。

1.5 药物敏感性试验

选取不同类型抗生素的代表药物进行药敏试验。取100 μL处于对数生长期的菌液均匀涂抹到LB平板上，晾干后，分别取不同药敏片置于平板上，倒扣放置。24 h后统计不同药物抑菌圈的大小，并以抗菌药物敏感试验标准来判断其敏感性。

2 结果

2.1 病原菌观察及分子鉴定结果

将病灶组织分离出的优势菌命名为QZG3。此菌株在TCBS选择培养基上的形态为：绿色，圆形，黏稠状(见图2)，在显微镜下可观察到QZG3菌株形状短小，长度0.8～2.1 μm；经革兰氏染色，判断QZG3菌株为革兰氏阴性菌。同时QZG3菌株的16S rDNA序列经NCBI数据库的BLAST比对，结果表明，此菌株与弧菌属相似性达99%～100%。系统进化树分析结果表明，该菌株与阿尔法克弧菌(Vibrioalfacsensis)聚为1支(见图3)，因此判断该菌株为阿尔法克弧菌。

图2 病原菌的形态观察Fig.2 Morphological observation of pathogenic bacteria

2.2 人工回感试验结果

QZG3菌株对健康绿鳍马面鲀的人工回感试验结果见表1(统计周期为7 d)。注射QZG3菌株组绿鳍马面鲀的累计死亡率为10%～30%，出现症状率为30%～90%，对照组(注射生理盐水)则未出现死亡情况和烂嘴症状。从感染再发病鱼的组织中分离出的优势菌株与QZG3表面形态一致，因此推断QZG3菌株为绿鳍马面鲀烂嘴症的致病菌株。

表1 不同浓度的QZG3菌株对绿鳍马面鲀的毒力测定结果Tab.1 Toxicity test results of different concentrations of QZG3 strains to T. modestus

2.3 药敏试验

QZG3菌株对10种抗生素的敏感性结果见表2。结果表明，QZG3菌株对恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感，对土霉素、青霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、四环素和红霉素表现出耐药性，对新霉素中度敏感。

表2 菌株QZG3的药敏特性Tab.2 Drug sensitivity of strain QZG3

3 讨论

皮肤溃烂是常见的养殖鱼类细菌性疾病之一，主要表现为烂嘴、烂尾、烂鳍等症状，其中烂嘴症不容小觑。患轻度烂嘴症的个体由于影响正常摄食而出现体形消瘦、肠炎等症状，严重患病个体则会出现体表大面积溃烂，甚至病原菌从伤口进入血液从而引发菌血症。鱼类皮肤溃烂大多由弧菌[5-6]或者气单胞菌[7]引起。弧菌是水产养殖生产中常见的致病菌，如引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征的副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)[8-9]、引起赤鱼工皮肤溃烂的创伤弧菌(V.vulnificus)[5]、引起林蛙烂嘴病的解藻朊酸弧菌(V.alginolyticus)[10]等。夏季水温较高，正是弧菌疾病的高发期。

注：括号中为菌株的GenBank登录号。Note:the GenBank login number of the strain is in parentheses.图3 通过邻接法构建的基于菌株QZG3及相关菌株16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of strain QZG3 and related bacteria was constructed by Neighbor-joining method

本研究发现，绿鳍马面鲀烂嘴症的致病菌为阿尔法克弧菌。此前未见相关的研究报道，这可能与此菌的宿主特异性有关。另一方面，国内关于绿鳍马面鲀的研究集中在养殖[11-12]、繁育[13]等方面，对细菌性疾病的研究相对较少。

目前我国水产养殖业存在因长期、过量使用抗生素而导致细菌耐药性增加、水产品中抗生素残留超标和养殖环境中抗生素污染等问题，已严重影响我国水产养殖业的健康发展[14]。本研究药敏试验结果表明，绿鳍马面鲀烂嘴症的致病菌——阿尔法克弧菌已经对土霉素、青霉素、红霉素、头孢氨苄、庆大霉素、卡那霉素、四环素等表现出耐药性，说明养殖生产过程中存在使用抗生素不规范现象。因此，在今后的养殖生产过程中，应该科学、规范地使用抗生素，非必须情况下避免使用，必须情况下也应该避免长期或者过量使用同一种抗生素。