城市生活污水中阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类滥用物质的高分辨质谱筛选及确证

原 帅，于治国，王海峰，向 平，施 妍，杨 欢，刘梦曦，骆如欣，沈保华

(1.司法鉴定科学研究院，上海市法医学重点实验室，上海市司法鉴定专业技术服务平台，司法部司法鉴定重点实验室，上海 200063；2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016；3.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092)

滥用物质是指连续使用后产生依赖性，并具有滥用倾向的精神活性物质。近些年，除冰毒、海洛因等传统的滥用物质外，不法分子为逃避打击而对毒品进行化学结构修饰，得到了与毒品相似或更强的新精神活性物质(new psychoactive substances, NPS)。根据最新的《2019年中国毒品形势报告》，甲基苯丙胺和海洛因仍是我国滥用人数最多的毒品[1]。新精神活性物质作为第三代毒品迅速扩张，我国于2019年5月1日起将芬太尼类物质整类列管。卡西酮类物质作为苯丙胺类新精神活性物质，在许多国家的毒品市场大量涌现，并导致多人死亡。自2014年起，我国将甲卡西酮等卡西酮类物质划入第一类管制精神药品。此外，地西泮等苯二氮卓类药物属于第二类管制精神药品，但作为安眠药的使用越发增多[2]。滥用物质泛滥将导致严重的公共卫生问题，因此，急需建立快速、精准、筛选范围广的滥用物质监测体系。

滥用物质监测最早是通过结合犯罪统计、医疗记录、毒品生产和缉获率等人口调查中获得，但是这种方法存在时间的滞后性以及人口的有限性等缺点[3]，导致低估滥用物质使用率等问题。2001年，Daughton[4]提出污水分析法，主要通过对污水中滥用物质及其代谢物浓度的测定统计滥用物质的使用情况，是一种客观、实时、准确、便捷、有效的监测技术。目前，包括我国在内的众多国家已经开展了该项技术的研究，并开发了不同的分析方法[5-9]。

生活污水中滥用物质含量少、干扰物质多，不能直接进入仪器进行分析，需要经过一系列的前处理过程以减少干扰性物质[10]。固相萃取法是最常见的前处理方法，其操作简单、绿色环保、重复性强[10]，可以提高污水中滥用物质的提取回收率，有效地分离分析物与干扰组分。提取浓缩后的样品大多采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对已知目标物进行分析，而在没有标准品或者无法短时间内优化方法的情况下很难完成快速检测。

高分辨质谱(HRMS)已广泛应用于新型涉毒药物案(事)件的鉴定及科学研究，并逐渐应用于污水中滥用物质的分析，特别是NPS分析[11-14]。与低分辨质谱相比，HRMS具有高通量、高分辨、高特异性、精确分子质量、多种扫描和碎裂组合等特点，此外，还可以在没有参考标准的情况下同时测定大量化合物[15]。因此，HRMS是监测污水中滥用物质的一种有效工具。

本研究拟建立超高效液相色谱-高分辨质谱联用法快速筛选及确证城市生活污水中阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类滥用物质，并将其应用于实际的城市生活污水样品分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Vanquish Flex UPLC超高效液相色谱仪、ScientificTMOrbitrapTMID-X高分辨质谱仪：美国Thermo Fisher Scientific公司产品；GX-274自动固相萃取仪：法国Gilson公司产品；MD200-2氮吹仪：杭州奥盛仪器有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

吗啡、单乙酰吗啡、可待因、羟考酮、哌替啶、曲马多、丁丙诺啡、美沙芬、芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼、乙酰芬太尼、舒芬太尼、丙烯酰芬太尼、2-氟芬太尼、奥芬太尼、卡芬太尼、甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亚甲基二氧基-N-乙基-苯丙胺(MDEA)、氟苯丙胺、甲卡西酮、卡西酮、1-苯基-2-甲氧基-1-戊酮、4-甲氧基甲卡西酮、3,4-亚甲二氧基甲卡西酮、3,4-亚甲二氧基乙卡西酮、阿普唑仑、溴西泮、地西泮、艾司唑仑、氟西泮、硝西泮、去甲西泮：均购自美国 Cerilliant公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；98%甲酸、甲酸铵、氨水(25%)：瑞士Fluka公司产品；盐酸：中国永华化学科技有限公司产品。

1.3 溶液配制

将上述36种对照品用甲醇配制成10 mg/L的混合溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。使用前取适量的对照品溶液，用甲醇稀释至所需浓度，制成混合标准溶液。

1.4 样品采集

从某地区不同区域的污水处理厂采集12个24 h复合污水样品，将所有样品存储在600 mL聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)容器内，并用盐酸调至pH 2左右，然后送至实验室进行分析。将样品保存在-20 ℃冰箱中，分析前取出，解冻至室温，避免多次冻融。

1.5 样品前处理

采用固相萃取法对污水样品进行浓缩、净化，具体操作如下：1) 将50 mL污水样品经玻璃微纤维滤纸过滤；2) 依次用4 mL甲醇、4 mL酸化水(pH 2，盐酸酸化)活化Oasis MCX固相萃取小柱，流速4 mL/min；3) 以2 mL/min的流速加载污水样品；4) 依次用4 mL纯化水、4 mL甲醇淋洗Oasis MCX固相萃取小柱，流速2 mL/min；5) 持续干燥直至固相萃取小柱干燥；6) 用4 mL 5%氨-甲醇溶液洗脱固相萃取小柱，流速1 mL/min；7) 在50 ℃下，用缓和的氮气流将洗脱液浓缩至200 μL；8) 用0.22 μm聚四氟乙烯过滤器过滤浓缩后的洗脱液；9) 将滤液转移至进样小瓶，直接进样。

1.6 实验条件

1.6.1色谱条件 Accucore Hypersil Gold column色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)，柱温为室温；流动相：A为2 mmol/L甲酸铵缓冲溶液(含0.1%甲酸)，B为乙腈-甲醇溶液(1∶1，V∶V，含0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵)；流速0.4 mL/min；进样量10 μL；梯度洗脱：0～6 min(95%～80%A)，6～14 min(80%～0%A)，14～16.5 min(0%A)，16.5～16.6 min(0%～95%A)，16.6～20 min(95%A)。

1.6.2质谱条件 加热电喷雾电离源(HESI)，正离子扫描模式；喷雾电压3 500 V；鞘气流速5 mL/min；辅助气流速10 L/min；毛细管温度325 ℃；喷雾温度350 ℃；数据采集模式为一级全扫描以及自动触发的二级质谱扫描(Full MS/dd MS2)；一级扫描分辨率设为60 000，质量扫描范围m/z80～1 200，最大注入时间50 ms；二级扫描分辨率设为15 000，质量扫描范围m/z100～1 000，最大注入时间22 ms，分离窗口为m/z1.6；碰撞能量设为20、40、60。

1.7 数据处理方法

本实验采用TraceFinder软件进行快速筛选。首先建立了生活污水中阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类共36种滥用物质的筛选数据库，利用其对照品溶液获得准确的保留时间以及相应的质谱信息等，列于表1。然后建立筛选方法，以保留时间、分子质量、碎片离子以及同位素分布为筛选依据，当样品中的某物质全部符合这4个条件时，才能判定为阳性。因此，使用该数据库进行滥用物质的筛选与确证时，其定性能力更强，得到的结果更加真实可靠，很大程度上降低了假阴性或假阳性结果出现的可能性。该分析方法的筛选参数如下：峰面积阈值5 000 000，保留时间窗口阈值20 s，最小碎片离子数为2，同位素相似度的阈值90%，同位素离子的允许强度偏差为10%，分子离子、碎片离子以及同位素的质量偏差均小于5×10-6。

2 结果与讨论

2.1 方法学评价

分别取不同来源的空白生活污水样品，按1.5节方法处理后进样分析；另取空白污水样品，添加适量的待测物对照品溶液，按1.5节方法处理后进样分析。结果表明，各待测物分离良好，且在保留时间处均未出现干扰峰，说明该方法的专属性强。此外，取若干份50 mL空白污水，添加适量的待测物对照品溶液，制得不同浓度的污水样品，按1.5节方法处理后进样分析，以信噪比为3时的浓度为检出限(LOD)。结果显示，36种滥用物质的LODs范围为5～20 ng/L。

选取50 ng/L污水样品，按1.5节方法处理后进样的峰面积为A，空白样品按1.5节方法处理后，加入相应浓度的对照品溶液，进样后的峰面积为B，对照品溶液进样后的峰面积为C，提取回收率=A/B×100%，基质效应=(B/C-1)×100%，其结果列于表2。结果表明，36种滥用物质经提取后，提取回收率为74.5%～104.1%，基质效应为-24.4%～21.2%，可以满足污水中36种滥用物质的日常监测。

2.2 实际样品检测

运用本方法分析12个实际生活污水样品，利用TraceFinder软件中已建立的标准数据库以及筛选方法进行快速筛选与确认。结果表明，12个污水样品中均检出滥用物质，且所有滥用物质的质量精度均小于5×10-6，列于表3。

上述样品中共检出4种苯二氮卓类物质，分别为地西泮、去甲西泮、艾司唑仑、阿普唑仑，其MS2谱图示于图1。地西泮是临床上用于镇静催眠、镇定抗焦虑的药物，在上述12个污水样品中均有检出，去甲西泮为地西泮的主要代谢产物，在样品4、5、6、7、8、10中有检出。有文献报道，在中国多个城市的污水中均有检出地西泮及其代谢物，如王聪聪等[16]在北京多个污水采样点均检测到地西泮及其代谢物；孙倩等[17]在厦门污水处理厂检测到地西泮的存在，但对污水中除地西泮以外的其他苯二氮卓类药物的研究较少。样品7和10中检出阿普唑仑，样品5、7、10、11、12中检出艾司唑仑，说明本方法可筛选发现更多的滥用物质。此外，在样品7和10中同时检出了阿普唑仑与艾司唑仑，表明在这2个样品的覆盖人群中使用苯二氮卓类药物的可能较多。部分欧美国家的污水样品中同时检出了地西泮及其他苯二氮卓类药物[18-19]。

在上述污水样品中共发现了吗啡、可待因、哌替啶、曲马多等4种阿片类物质，其MS2谱图示于图2。在阿片类滥用物质中，海洛因消费量最大，是我国监控、查禁的主要毒品之一。在污水分析中常采用吗啡来估算海洛因的使用量。而污水中吗啡的主要来源有：吗啡本身作为麻醉性镇痛药使用、海洛因代谢、可待因代谢。在样品2、3、5、7、8、9、10中检出吗啡，样品2、3、4、5、7、9、10中检出可待因。根据文献[20]报道，在北京、哈尔滨、西安、兰州、银川、太原、石家庄、武汉、济南、南京、杭州、南宁、广州、成都、昆明、贵阳、大连、洛阳、青岛、苏州、厦门、深圳等城市的生活污水中均检出吗啡与可待因。吗啡、可待因在国外的应用也较为广泛，如在马来西亚[21]、西班牙[22]、美国、法国、德国[7,23-24]等国家的污水中均有检出。曲马多和哌替啶这两种药品为我国生产及使用的镇痛麻醉药品，以往未在生活污水中进行筛查。本研究在样品3中检出了曲马多，样品4和10中检出了哌替啶。近年来，这两种药物滥用较为广泛，除临床使用外，某些海洛因依赖者在无法获得海洛因的情况下，会以这两种药物作为替代品使用。

表1 污水中36种阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类滥用物质的HRMS数据库Table 1 HRMS database of 36 opioids, amphetamines and benzodiazepines in wastewater

表2 污水中36种滥用物质的提取回收率与基质效应(n=6)Table 2 Extraction recovery and matrix effect of 36 abused substances in wastewater (n=6)

表3 污水样品的筛选结果Table 3 Screening results of wastewater samples

续表3

在样品2、4、8中检出甲基苯丙胺，其MS2谱图示于图3。此外，北京、南京、西安、大连等城市的污水样品中也均有检出[25]。甲基苯丙胺在其他国家的滥用也非常普遍[26-27]，因此需要进一步加强管控与治理。

注：a.地西泮；b.去甲西泮；c.阿普唑仑；d.艾司唑仑图1 4种苯二氮卓类物质的MS2谱图Fig.1 MS2 spectra of four benzodiazepines

注：a.可待因；b.吗啡；c.哌替啶；d.曲马多图2 4种阿片类物质的MS2谱图Fig.2 MS2 spectra of four opioids

图3 甲基苯丙胺的MS2谱图Fig.3 MS2 spectrum of methamphetamine

12个污水样品中未发现芬太尼及卡西酮等NPS。不同国家和地区，NPS在污水中表现出不同的流行特征。如Iria等[12]利用HRMS筛选意大利4个城市中的NPS，发现了卡西酮类的NPS[12]；Richard等[14]利用HRMS监测澳大利亚NPS的使用情况，在所有区域和大都市污水处理厂中共发现22种不同的NPS，其中包括多种卡西酮类NPS。

上述12个污水样品取自某地区不同区域，筛选结果也不相同。其中，样品1中仅检出地西泮，而样品10中检出的滥用物质最多，分别为地西泮、去甲西泮、艾司唑仑、阿普唑仑等4种苯二氮卓类物质以及吗啡、可待因、哌替啶等3种阿片类物质，其全扫描总离子流图示于图4。表明在不同区域，阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类滥用物质的流行性不同。

2.3 结果的影响因素

城市生活污水中目标化合物的出现与浓度可能受多种因素的影响，如采样过程、下水道环境、目标化合物的扩散和分散效应等。其中，采样是污水分析的关键步骤，科学的采样是获得准确数据的前提。污水的采样方法包括连续取样、流量比例连续取样、随机单次取样等。本实验每2 h采集500 mL污水样品，然后将同一天收集的12个污水样品混合，最后将得到的24 h复合样品装入600 mL PET瓶中。与其他方法相比，该采样方法可以有效减少采样误差，获得准确的监测数据。

此外，由于污水中某些化合物的扩散和分散效应，不同的采样高度也可能影响监测数据的准确性。本实验使用自动采样器从水下50 cm采集污水样品，比较不同污水处理厂中目标化合物的出现情况，可以消除分析物的扩散和分散效应。下水道系统中目标化合物的转化、降解、稳定性和掩蔽效应也是需要考虑的重要方面，然而，目前还未见该方面的研究报道。因此，我们下一步将对此进行探究。

注：吗啡1.18 min；可待因3.74 min；哌替啶8.89 min；艾司唑仑10.89 min；阿普唑仑11.23 min；去甲西泮11.59 min；地西泮11.94 min 图4 样品10的TIC图Fig.4 Total current chromatogram of sample 10

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-高分辨质谱法测定城市生活污水中阿片类、苯丙胺类以及苯二氮卓类滥用物质，构建了36种滥用物质的标准数据库及筛选方法，并将其应用到12个取自不同区域的污水样品中，筛选并确认了吗啡、可待因、哌替啶、曲马多4种阿片类物质，甲基苯丙胺1种苯丙胺类物质，以及地西泮、去甲西泮、艾司唑仑、阿普唑仑4种苯二氮卓类物质。