HPLC法测定金酸萍颗粒中蒽醌类成分的含量

2021-12-02杜继权吴春玲张志君

中国民族民间医药 2021年21期

杜继权吴春玲张志君

湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100

中成药金酸萍颗粒由北刘寄奴(SiphonostegiachinensisBenth.)、酸模(RumexacetosaL.)、萍(Marsilea quadrifolia L.)3味药组成，具有清热解毒、利湿退黄的功效[1]，主要用于治疗急性黄疸型、慢性、重症等类型肝炎，有降低转氨酶、恢复肝功能的作用[2-4]。方中臣药酸模，系蓼科酸模属植物，在我国广泛分布，民间作“土大黄”使用，根主要含有大黄素型蒽醌类化合物，具有清热解毒、凉血止血之功[5-7]。

金酸萍颗粒标准WS3-B-1561-93收载于部颁标准(中药成方制剂第八册)，原标准只对性状、酸模的薄层鉴别和通则进行检测[8]，而无含量测定项，不能全面反映酸模质量。因此，金酸萍颗粒中3个蒽醌类成分的定量测定方法的建立，为金酸萍颗粒的质量标准修订与提高提供依据，更好的控制金酸萍颗粒的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器北京清博华LC300型高效液相色谱仪，UV检测器；Hypersill GOLD C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；超声波清洗器(上海船舶电子设备研究所 )；GWP十万分之一分析天平(型号：XS105DU)。

1.2 试药大黄素对照品(批号：110756-201512)、大黄酚对照品(批号：110757-201607)和大黄素甲醚对照品(批号：110758-201817)均购自中国食品药品检定研究院；金酸萍颗粒(批号：20190204，20200707，20200901，20201001，20201002，20201003，20201004，20201005，20201101，20201102，20201103)和缺酸模的阴性样品均由湖北福人金身药业有限公司提供；甲醇为色谱级(天津欧博凯化工有限公司)；实验用水为CM-RO-C2型超纯水机制水，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱: Hypersill GOLD C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A):0.1%磷酸水溶液(B)=85∶15；流速为:1.0 mL/min；UV：254 nm；柱温控制在25 ℃；进样体积20 μL。所检测成分理论塔板数不低于5000。

2.2 溶液的制备对照品溶液：分别精密称得适量上述对照品于量瓶，加甲醇溶解并定容，得对照品贮备液，4 ℃避光保存。精密移取1.25 mL贮备液于 10 mL 棕色量瓶，定容得浓度为大黄素20 μg/mL、大黄酚9 μg/mL以及大黄素甲醚16 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：精准称取金酸萍颗粒粉末1 g到具塞锥形瓶中，加25 mL甲醇，超声提取30 min，放冷后用甲醇补重，取5 mL续滤液水浴蒸干，然后依次加入水10 mL、浓盐酸2 mL及二氯甲烷10 mL，热回流水解30 min，待冷确后倒到60 mL分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗涤2次，并入分液漏斗中，静置后分取二氯甲烷层，酸液再以二氯甲烷萃取，共2次，每次10 mL，合并并回收二氯甲烷，残渣加适量甲醇溶解，转到10 mL量瓶定容，即得[10-12]。

阴性样品溶液：取阴性样品，其制备操作与供试品处理方法相同，即得。

2.3 专属性试验取“2.2”项下制备的三种溶液，照“2.1”项下条件采集色谱图，结果见图1。由图1可知，在既定色谱条件下， A和B中3个色谱峰的保留时间均能相对应，而C在相应的时间未出峰，说明专属性较强。

2.4 线性关系考察取6个10 mL棕色量瓶，移液枪依次准确加入0.3125 mL、0.625 mL、1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL、5 mL对照品贮备液，用甲醇稀释至刻度线，得到6个不同浓度的对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下，浓度从低到高依次测定，并对其数据处理。峰面积为Y轴，浓度(μg/mL)为X轴，得到3个成分的标准曲线：大黄素y=82.6569x+36.4847，r=1.0000；大黄酚y=142.3478x+18.1365，r=1.0000；大黄素甲醚y=22.9311x+11.4092，r=0.9999。3个成分依次在5～80 μg/mL， 2.25～36 μg/mL和4～64 μg/mL与峰响应值相关性良好。

注：1.大黄素；2.大黄酚；3.大黄素甲醚图1 对照品(A)、供试品(B)及阴性样品 (C)的HPLC色谱图

2.5 仪器精密度试验精密吸取20 μL对照品溶液，依“2.1”色谱条件，重复进样6次测定3个成分的峰面积，并计算得大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.93%、1.13%和0.61%，说明该仪器精密度较好。

2.6 重复性试验按“2.2”项制备6份供试品溶液(批号：20190204)，照“2.1”项色谱条件，采集峰面积，计算得大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD分别为1.29%、1.96%、0.88%，表明该法重复性良好。

2.7 稳定性试验取同一供试品溶液(样品批号：20190204)，以“2.1”项色谱条件下，在0～24 h每隔一段时间测定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积，并计算峰面积的RSD(n=6)分别为0.71%、0.83%、1.14%，表明在24 h内供试品溶液比较稳定。

2.8 加样回收率试验取知道含量的样品(批号：20190204)约1 g，精密称定，以1∶0.5，1∶1，1∶1.5的比例精准加入对照品，再按“2.2”项下方法制备，每个比例平行3份，照“2.1”色谱条件测定峰面积，计算回收率及RSD。大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均加样回收率分别为96.12%、104.22%和97.41%，RSD分别为2.47%、1.57%和1.96%。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n=9)

2.9 样品含量测定取11批次样品，依法制备样品并测定其峰面积，以标准曲线计算样品3个成分的含量(按干燥品计)，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (mg·g-1,n=2)

3 讨论

3.1 样品提取条件的优化在制备供试品溶液时，摸索了不同提取方式(超声和加热回流方式分别提取30 min和45 min)、提取溶剂(甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇)、溶剂用量(12.5 mL、25 mL、50 mL)、盐酸用量(1 mL、2 mL、3 mL)和水解时间(30 min、45 min、60 min)对待测组分含量的影响。结果显示以加入25 mL甲醇，超声30min，加入盐酸2 mL，水解30min的提取条件较佳。

3.2 色谱条件的优化供试品和对照品溶液的全波长扫描结果显示，两溶液最大吸收波长均在 254 nm 和285 nm附近，同时参考2015版中国药典大黄中蒽醌类成分的含量测定方法[13]，检测波长确定为254 nm。曾对甲醇-0.1%磷酸溶液的比例进行考察，发现以体积比为85∶15时3种成分的保留时间适中，理论塔板数较高，峰形良好，可满足快速定量检验的要求。

3.3 样品测定结果分析表2含量测定结果显示，样品中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量分别为1.2468～1.6092 mg/g、0.3259～0.5183 mg/g、0.8122～1.2486 mg/g，该厂提供的不同批次样品3个蒽醌成分的含量水平波动较大，推测原因可能与原料药的质量差异有关，因此应当严格控制原料药的质量，把控生产环节，以保证药品质量的稳定。