线粒体靶向递送PCN-224体系的构建与表征

余文杰, 杨明月, 华成焕, 彭 娜 *, 刘 义

(1. 武汉科技大学 化学与化工学院,湖北 武汉 430081; 2. 天津工业大学 化学与化工学院,天津 300387)

光动力疗法(PDT)是一种利用光敏剂(PSs)在特定波长的激发光下产生具有细胞毒性的活性氧(ROS),从而诱导细胞凋亡和组织损伤的抗肿瘤治疗方法[1]。因此,可以通过调节光照条件(例如光照时间和光照强度)来精确调控光动力治疗的效果[2]。然而,ROS的半衰期很短(<40 ns),只能作用于其产生的位点附近(<20 nm),这一范围远远小于细胞尺寸[3],故许多研究者致力于设计、制备多功能纳米载体,将各类PSs递送至肿瘤组织后,进一步将其递送到相关细胞器(线粒体、溶酶体等),以达到在细胞器附近原位生成ROS的目的,从而提高PDT治疗效果[4-6]。

线粒体作为细胞的动力工厂,在细胞新陈代谢中起着至关重要的作用,线粒体的损伤将导致一系列细胞功能异常。由于线粒体可以调节细胞程序性死亡而不会引起任何不良的炎症反应,是提高PDT治疗效果的优良细胞器靶标[7-9]。带离域正电荷的亲脂性三苯基膦(TPP)可以选择性地结合到带负电的线粒体膜上,主要因为其化学结构中的3个苯基使其具有很强的亲脂性,同时,磷原子上的正电荷可以离域到3个苯环上形成离域正电荷,使TPP易于渗透磷脂双分子层,从而将TPP修饰过的纳米粒子富集于线粒体[10-14]。Mou等[15]合成了一种新型的绿色二氧化钛(G-TiO2-x),其近红外光(920 nm)吸收强于黑色二氧化钛(B-TiO2-x),为了降低激光功率密度和副作用,提高光动力治疗效果,将TPP配体修饰到G-TiO2-x上,得到的纳米粒子用于靶向线粒体的PDT和光热的联合治疗,该纳米粒子在体外和体内都表现出优异的治疗效果。

此外,在用于递送PSs的多功能纳米载体中,具有多孔晶体结构的金属有机骨架(MOF)因其具有较高的比表面积和易于调节的孔径优势,受到广泛关注[16]。特别是基于Zr(Ⅳ)的卟啉金属有机框架纳米粒子PCN-224,不仅可以作为载药的纳米载体[17],而且本身也是一种具有很强渗透力的PSs[18]。

本研究合成含TPP的两亲性聚合物,通过两亲性聚合物的自组装,将光敏剂PCN-224包封进胶束中,得到具有靶向线粒体功能的纳米粒子(Scheme 1)。并通过核磁共振谱(1H NMR)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、荧光光谱(FL)、电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)等,表征了合成的纳米粒子的理化性质;通过荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA),表征了合成的纳米粒子产生ROS的能力;通过共聚焦显微镜(CLSM),观察纳米粒子在细胞内部的分布情况;通过细胞毒性(MTT)测试,检测纳米粒子对小鼠乳腺癌细胞的毒性。结果证明将光敏剂包封进胶束后,其产生ROS的能力明显高于卟啉配体,且含TPP的胶束成功将光敏剂PCN-224富集于线粒体,对癌细胞的毒性大于单纯的光敏剂PCN-224,为后续抗肿瘤的研究奠定了理论基础。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-2450型紫外/可见分光光度计;Agilent Varian 600 MHz型核磁共振仪(TMS为内标);Bruker TENSOR27型红外光谱仪;JEM-2100UHR型透射电子显微镜;Malvern Instruments Nano-ZS ZEN3600型粒度仪;Shimadzu RF-6000型分光光度计;Agilent 730型电感耦合等离子体发射光谱仪。

半胱胺盐酸盐、三氟乙酸乙酯、3-巯基丙酸甲酯,阿拉丁工业有限公司;5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、苯甲酸(BA),梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;聚乙二醇2000(PEG2000)、 ZrOCl28H2O, Sigma-Aldrich; 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA),上海毕得医药科技股份有限公司;RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS),卡尔斯巴德;活性氧检测试剂盒、Mito-Tracker Red CMXRos(线粒体红色荧光探针)、Hoechst 33342染色液,碧云天生物科技有限公司;其余所用试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 合成

(1) 两亲性聚合物的合成

两端具有不饱和键的硫代硫缩酮分子(TK)的合成：将10 g半光胺盐酸盐和24 mL三乙胺溶解在250 mL甲醇中,将溶液置于冰浴中,加入10 mL三氟乙酸乙酯搅拌3 h后,室温继续反应12 h,经萃取、洗涤后,经硅胶柱层析纯化得中间产物2-巯基三氟乙酰胺。将5.7 g 2-巯基三氟乙酰胺,4.4 g的3-巯基丙酸甲酯和2 g的丙酮溶于50 mL乙腈中,冰浴冷却,加入13 mL的三氟化硼乙醚，继续反应2 h。反应结束后,经萃取、洗涤后利用柱层析分离得到产物,加入6 mol/L氢氧化钠溶液使三氟乙酸酯基团脱保护,得到TK-NH2。将0.64 g的TK-NH2溶于15 mL二氯甲烷中,置于冰浴中,分别加入2.3 mL三乙胺和1.1 mL丙烯酰氯,反应5 h后,室温继续反应19 h,经萃取、干燥得两端具有不饱和键的硫代硫缩酮分子(TK)。

将0.262 g的三苯基膦溶于20 mL无水乙腈中,升温至100 ℃,在氮气保护下,缓慢滴加5 mL溶解有0.195 g 6-溴己酸的乙腈,滴毕,氮气保护下继续反应16 h得TPP-COOH。将8.0 g的PEG2000溶于10 mL无水二氯甲烷中,置于冰浴中,氮气保护下,加入2 mL甲基磺酰氯和2 mL三乙胺后,室温反应24 h,经过滤、浓缩后,加入大量乙醚沉淀,减压抽滤后,得到淡黄色固体,干燥后加入100 mL 体积分数为25%的氨水,室温反应4 d,敞口放置3 d,用NaOH调节溶液pH至13,经萃取、干燥后,用乙醚沉淀,减压抽滤得到固体粗产物,重复二氯甲烷溶解、乙醚沉淀、过滤操作两遍,所得固体充分干燥后即为NH2-PEG-NH2。将2.265 g的TPP-COOH溶于40 mL无水二氯甲烷中,加入0.576 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.008 gN,N′-二环己基碳二亚胺(DCC),搅拌1 h,加入30 mL溶解有11.988 g NH2-PEG-NH2的无水二氯甲烷,室温反应12 h,经浓缩、乙醚沉淀后得NH2-PEG-TPP。

将TK、 NH2-PEG-TPP、 1H-咪唑-2-胺混合于双颈烧瓶中,在氮气保护下,于120 ℃下反应10 h。粗品溶于适量二甲亚砜(DMSO)中,透析、冷冻干燥备用。

(2) PCN-224的合成

将100 mg TCPP、 300 mg ZrOCl2·8H2O和2.8 g BA依次溶于装有100 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)的250 mL圆底烧瓶中,搅拌至固体溶解后,在温度为90 ℃、转速为300 r/min条件下,恒温反应5 h。悬浊液通过离心分离得到的固体粒子依次用DMF和蒸馏水洗涤3次,避光保存。

(3) 胶束@PCN-224的制备

将1 mg PCN-224分散到5 mL蒸馏水中,向其中加入1 mL溶解有10 mg两亲性聚合物的DMSO,室温搅拌12 h后,转移到透析袋(3500)中透析48 h。透析结束后将透析液冷冻干燥备用。

1.3 性能或活性测试

(1) PCN-224稳定性测试

将PCN-224分散于水溶液中,利用动态光散射(DLS)测试其粒径、电位,测试之后,将其放置1 d后继续进行DLS测试,该步骤一共重复7次,从而得到PCN-224在蒸馏水中的稳定性数据。

(2) 利用DCFH-DA检测ROS

取0.5 mg的TCPP分散到10 mL的磷酸缓冲溶液(10 mmol/L, pH=7.4, PBS)中配成50 μg/mL的样品,取一定质量的PCN-224、胶束@PCN-224分散到PBS中配制含PCN-224质量浓度为50 μg/mL的样品,随后,在相同体积的样品溶液中分别加入相同含量的DCFH-DA(10 μM)活化后的2′,7′-二氯二氢荧光素(DCFH)溶液,DCFH被ROS氧化为2′,7′-二氯荧光素(DCF)后具有荧光,在660 nm激发光(1.5 W/cm2)照射下光照2 min后,立即测得其荧光光谱,PBS作为空白对照。

(3) 细胞摄取及细胞内ROS检测

将小鼠乳腺癌细胞(4T1)在小皿中孵育24 h,然后与PCN-224、胶束@PCN-224(光敏剂PCN-224质量浓度均为15.0 μg/mL)共孵育24 h,随后,移除培养基,并将细胞用PBS溶液洗涤3次,加入含有10 μM DCFH-DA的无血清培养基孵育15 min后,用新鲜培养基洗涤3次,以去除多余的DCFH-DA染色液,在660 nm(20 mW/cm2)激光下光照一段时间,随后用PBS洗涤3次,再加入含有200 nmol/L Mito-Tracker Red CMXRos的无血清培养基孵育20 min,以标记细胞内线粒体,随后用PBS溶液洗涤细胞3次后,加入含有10 μg/mL的Hoechst 33342染色液孵育20 min,以标记细胞核,用PBS洗涤数次除去多余的染色液,用共聚焦显微镜扫描拍照。

(4) 细胞毒性测试

将4T1细胞以10000个/孔的数量接种到96孔板中,孵育24 h后,移除培养基,往各孔中加入100 μL含有不同质量浓度的PCN-224的纳米粒子的培养基,孵育24 h后,移除培养基,重新加入新鲜培养基,用20 mW/cm2的排灯照射30 min后放入培养箱继续孵育24 h,随后往各孔中加入20 μL 3-(4,5)-二甲基噻唑-2-甲基-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT, 5 mg/mL),继续孵育4 h,最后,移除培养基,往各孔中加入100 μL DMSO,用来溶解结晶的甲瓒。使用酶标仪测量各孔的光密度(OD),并计算细胞存活率。

2 结果与讨论

2.1 PCN-224的表征

(1)1H NMR

合成的两亲性聚合物的核磁谱如图1所示。从图1中可以看出,TK键的甲基特征峰a(1.54), PEG的亚甲基特征峰b(3.50),咪唑环上—CH=CH—的特征峰c(6.94～6.69),以及TPP的芳香环特征峰d(7.94～7.73),由此证明两亲性聚合物已成功合成。

δ图1 两亲性聚合物的1H NMR谱图

(2) 粒径分析,TEM和IR

通过溶剂热法,合成了光敏剂PCN-224, PCN-224框架由Zr6簇和配体TCPP组成,其中,Zr具有高稳定性,配体TCPP具有对称的分子结构,其四个羧基与Zr—O键进行酯化反应后形成Zr—O—C,将进一步提高PCN-224的稳定性和产生ROS效果。

通过DLS测得的结果来证明PCN-224是否具有纳米级尺寸,这将有利于后续的包封实验。如图2所示,通过DLS测得PCN-224的水合粒径约为100 nm,表明成功合成了具有纳米级尺寸的PCN-224。如图3a所示,通过TEM观察到PCN-224的粒径约为80 nm,且具有规则的类球形。DLS测得的粒径大于TEM观察的结果,这是因为：一方面,TEM测试的PCN-224是干燥后的,而DLS测试的水合粒径,在制备TEM样品时,干燥后的PCN-224会失去表面附着的水分子,导致粒径变小;另一方面,与TEM在干燥状态下测定的尺寸相比,水合粒径的明显增加,可能是由于PCN-224的表面疏水性,导致纳米粒子在水溶液中的轻微聚集,从而导致水合粒径的增加。如图3b所示,对透射电镜图中PCN-224粒子进行数量统计,得到PCN-224的粒径分布直方图,大部分PCN-224的粒径分布在80～90 nm。

粒径/nm

图3 PCN-224的透射电镜照片和粒径分布

通过对照有机配体TCPP、 PCN-224的FT-IR谱图,判断PCN-224是否成功合成。从图4 TCPP的红外光谱图中可以看到,在1670～1725 cm-1存在C=O的吸收峰,而合成的PCN-224的红外光谱图在1700 cm-1附近无吸收峰;在1650 cm-1附近出现类似TCPP在1700 cm-1附近的羰基吸收峰。由此可知,在合成PCN-224的过程中,TCPP的羧基变成羧酸盐,使得羰基的峰位置发生了变化;在650 cm-1处的峰是由Zr—OH键引起的,从而证明了PCN-224的成功合成。

ν/cm-1

(3) UV-Vis和FL

如图5a所示,通过对PCN-224的UV-Vis光谱的分析,可以看到PCN-224在425 nm处有一个强吸收峰(Soret带),在500～700 nm之间有4个弱吸收峰(Q带)[19],这4个小峰的存在归因于金属有机框架PCN-224中存在的卟啉配体在500～700 nm之间的Q带,而紫外可见吸收光谱反映的主要是分子中的生色团和助色团,所以Zr基金属的加入不会引起有机配体TCPP的UV-Vis光谱发生变化。由此可知,合成的PCN-224中存在卟啉结构。荧光发射光谱测试是在某一固定波长的激发光作用下检测PCN-224纳米颗粒的荧光强度在不同波长处的分布情况。如图5b所示,以440 nm激发波长作为激发光进行发射光谱的测试,可以观察到PCN-224纳米粒子的光致发光(PL)光谱在红光区680 nm处出现发射峰,表明此时的荧光强度最强。卟啉有机配体TCPP具有很强的荧光性能,通过对合成的PCN-224进行荧光发射光谱的测试,进一步证明PCN-224中存在配体TCPP结构。

λ/nm

(4) PCN-224的稳定性

通过DLS测试,得到7 d内PCN-224在水溶液中的粒径电位数据,探究PCN-224在水溶液中的稳定性。如图6所示,可以看到7 d内用DLS测得的数据曲线波动不大。其中,PCN-224的水合粒径均为100 nm左右,电位约为+30 mV,两个图中曲线的平缓程度证明合成的PCN-224在水溶液中有较好的稳定性,表明PCN-224的结构不易坍塌。

时间/d

2.2 胶束@PCN-224的表征

通过DLS测试得到PCN-224包封进胶束后的粒径电位变化,结果见表1。由表1可知,当PCN-224包封进胶束后,纳米粒子的粒径由132.7 nm增大到136.7 nm,电势由+13.5 mV降低到+7.04 mV。

表1 胶束、PCN-224、胶束@PCN-224的粒径、电势和多分散系数

通过对照PCN-224、胶束、胶束@PCN-224的FT-IR图谱,判断PCN-224是否成功包封进胶束中,其IR谱图见图7。由图7可知,胶束本身在1400 cm-1左右没有特征峰,而包封PCN-224后,在1403 cm-1出现了特征峰,该峰为PCN-224羧酸基团中的O—H弯曲振动峰。

通过ICP-OES测得纳米粒子中包封的金属Zr的质量为215.2 μg,以及投入的PCN-224中Zr的质量为250.3 μg,换算得到胶束@PCN-224中包封的PCN-224的质量为0.85 mg,计算得到胶束@PCN-224中PCN-224的载药量为7.91%。

2.3 体外ROS检测分析

相同浓度的TCPP、PCN-224、胶束、胶束@PCN-224在光照之后产生ROS的情况,如图8所示。荧光强度越高,说明光照产生的ROS越多。PCN-224与TCPP相比较,发现由金属Zr和TCPP合成金属有机框架后,其产生ROS的能力大大增强,这是由于金属有机框架的结构使得TCPP周期性地排列在阵列中,能够有效降低激发能的猝灭;同时,框架的多孔性也有利于底物的进入[20-21]。将PCN-224与胶束@PCN-224对比,发现当PCN-224被包封进胶束后,其产生ROS的能力下降,这可能是由于胶束中所含的TK被ROS裂解,从而消耗了一部分ROS。将TCPP和胶束@PCN-224对比,可知胶束@PCN-224产生ROS的能力明显强于TCPP,说明胶束包封了PCN-224之后仍具有较强的产生ROS的效果。

2.4 4T1细胞对纳米粒子的摄取

为了研究经TPP修饰过的两亲性聚合物的线粒体靶向作用,本研究应用CLSM来评估PCN-224和胶束@PCN-224在4T1细胞中的分布情况。PDT所产生的ROS用DCFH-DA标记,线粒体用Mito-Tracker Red CMXRos染色,细胞核用Hoechst 33342染色,PCN-224因其本身能在420 nm激发光下发出约650 nm的荧光,因此不需要染料进行染色即可从共聚焦显微镜下观察到PCN-224。纳米粒子进入细胞后的分布如图9所示,从图9a中可以看到与PCN-224共孵育的4T1细胞观察到少量的紫色荧光,且紫色与蓝色标记的细胞核位置几乎相同,而红色荧光标记的线粒体和紫色荧光位置不同,表明PCN-224本身进入细胞的能力有限,且进入细胞后也不会主动富集于线粒体,而是会扩散到细胞核中。从图9b中可以看到,与胶束@PCN-224共孵育的4T1细胞能观察到明显的紫色荧光,且与红色荧光标记的线粒体重叠的部分较多,说明胶束@PCN-224能提高PCN-224进入细胞的能力,且在TPP的作用下,将其靶向递送到线粒体。

图9 纳米粒子在细胞内的分布*

纳米粒子进入细胞后产生的ROS分布如图10所示,从图10a中可以看到,绿色荧光标记的ROS与红色荧光标记的线粒体和蓝色荧光标记的细胞核都有所重叠,但绿色荧光强度太弱,说明进入细胞有限的PCN-224产生的ROS不足。从图10b中可以看到,与胶束@PCN-224共孵育的4T1细胞能观察到明显的绿色荧光,且绿色荧光的位置与紫色荧光和红色荧光标记的线粒体一致,说明胶束@PCN-224进入细胞后在TPP的作用下靶向到线粒体,且在线粒体处经光照后将产生足够的ROS。CLSM的结果有效说明了含TPP的两亲性聚合物的线粒体靶向能力。

图10 细胞内产生ROS的分布*

2.5 纳米粒子对4T1细胞的毒性

为了进一步研究经TPP修饰过的两亲性聚合物的线粒体靶向作用,本研究应用MTT法来评估PCN-224和胶束@PCN-224对4T1细胞的毒性。由图11可见,随着PCN-224质量浓度的增加,在没有光照的条件下,PCN-224、胶束@PCN-224均对4T1细胞有低的细胞毒性,而在光照条件下,PCN-224、胶束@PCN-224对4T1细胞毒性的影响都逐渐增大,且在最大药物浓度时细胞存活率分别为32 %、29 %,将相同质量浓度下的PCN-224和胶束@PCN-224对比,可以看到后者对4T1细胞的毒性均大于前者,这一结果进一步证明了含TPP的两亲性聚合物的线粒体靶向作用,实验结果表明所合成的纳米粒子增强了PDT效果。

cPCN-224/μM

合成了具有线粒体靶向的两亲性聚合物,并通过水热法制备得到了具有纳米级尺寸的光敏剂PCN-224,随后利用两亲性聚合物的自组装,将PCN-224包封进胶束,得到具有线粒体靶向功能的纳米粒子(载药量7.91%)。最后,利用荧光探针DCFH-DA对ROS的特异性识别,在相同条件下测试了各体系的荧光强度,结果证明金属有机框架PCN-224有效提高了TCPP产生ROS的效果;将其包封进胶束后,胶束@PCN-224仍具有较强的产生ROS的效果,利用CLSM、MTT测试证明了胶束具有线粒体靶向功能,能将PCN-224主动靶向至线粒体,有效增强了PDT效果。该纳米体系的构建有利于提高PDT治疗效果。