实时荧光定量PCR技术在生物饲料中的应用

康凌宇， 倪 忠， 武俊明， 陈华友*

（1.江苏大学生命科学学院，江苏镇江 212000；2.江苏中兴药业有限公司，江苏镇江 212000）

随着我国畜牧饲料行业的发展，生物饲料成为研究热点之一。生物饲料是通过基因工程、蛋白质工程、发酵工程等现代生物技术开发的新型饲料产品 （蔡辉益等，2014），在提高动物的生产性能、饲料的适口性和消化率，降低抗生素使用，降低发病率和提高成活率方面展现出巨大的潜力。发酵菌种是生物饲料的重要组成部分，特色功能菌株的筛选、菌株的组合效果是生物饲料产业化的研究方向。近年来，实时荧光定量PCR技术因其独特的优点，被广泛应用于基础科学研究、转基因产品和食品安全检测、医学诊断等研究实践领域，但在生物饲料的检测中应用较少，与传统的基于微生物培养的检测方法相比，实时荧光定量PCR技术更加省时省力。因此，本文对实时荧光定量PCR的原理、技术分类和在生物饲料中的应用进展进行综述，并总结了实时荧光定量PCR在生物饲料实验中的注意事项。

1 实时荧光定量PCR的原理

实时荧光定量PCR（qPCR）是以常规PCR为基础的一种新型核酸定量技术。其原理是在反应体系中加入荧光化学物质，随着PCR反应过程中扩增产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加，通过荧光信号变化实时监测整个PCR反应进程，将结果绘制成荧光扩增曲线图，从而定量定性分析起始模板。PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在荧光信号指数扩增阶段，荧光信号达到阈值，且荧光信号远高于背景信号，这种情况下产生的循环数称为Ct值，通过Ct值对起始模板进行定量分析（Kozera等，2013）。在此反应阶段，反应组分不受限制，Ct值重复性高，是比在终端测定累计PCR产物量更为可靠的测量起始拷贝数的方法（Giulietti等，2001）。

2 实时荧光定量PCR技术检测方法和定量方法分类

2.1 检测方法 根据实时荧光定量PCR所用的荧光模式不同，其方法可分为DNA染料法和荧光探针法。SYBR GreenⅠ是应用最广泛的一种荧光染料，仅能与DNA双链结合，只有结合到DNA双链上的SYBR染料才能够发射荧光信号，没有结合的不发射荧光，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。由于SYBR GreenⅠ可以和任何dsDNA的小沟结合，因此需要通过熔融曲线分析来检查扩增片段的特异性 （Lin等，2014）。EvaGreen是替代 SYBR Green的第三代dsDNA结合染料，相比于非饱和的SYBR Green染料，EvaGreen染料稳定性和灵敏度更强，对PCR反应的抑制性更小，在饱和情况下产生的荧光信号更强（Mao 等，2007）。

TaqMan探针是使用最广泛的荧光探针，当探针完整时，荧光报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收；在PCR延伸阶段，Taq酶的5"端外切酶活性把探针降解，使得报告基团与淬灭基团分离，报告基团发出荧光信号；其可以利用多种荧光报告基团同时进行多重实时荧光定量PCR分析，特异性较强（Swayne 等，2011）。

2.2 定量方法

2.2.1 绝对定量 绝对定量是使用已知的标准曲线对未知样品进行定量分析的一种方法。绝对定量的标准品一般是指含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、cDNA以及PCR产物等，将标准品倍比稀释并检测每个稀释度的Ct值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线（Dhanasekaran等，2010），通过标准曲线推算未知样品的初始量。

2.2.2 相对定量 相对定量是在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本的量的变化，也就是比较经过处理的样本和未经处理的样本之间的相对基因表达差异。相对定量又包括比较标准曲线的相对定量和比较Ct值的相对定量。前者能准确地量化初始材料的载量，检测的结果是目的基因与参照基因的比值，只要参照基因恒定，比值的变化也就反映了目的基因的变化（Livak等，2001）。后者是同时扩增待测靶基因片段和一个内源性管家基因片段，通过数学公式计算相对量；这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致，所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响（Wang等，2019）。

3 实时荧光定量PCR技术在生物饲料中的应用

3.1 有害菌检测 饲料在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中存在受到微生物污染的可能性，检测饲料中的致病菌至关重要。由沙门菌引起的食源性疾病居我国细菌性食源性疾病的首位，其既能引起多种动物感染，也常引起人类食物中毒等群体暴发性事件。阮靖华等 （2018）以沙门菌invA基因作为构建质粒的靶基因进行绝对定量，该法对基因组DNA的检测灵敏度达17 copies/μL，饲料样品的检出率与国标法一致。杨美荣等（2015）也验证了以DNA为基础的沙门菌检测方法的特异性，荧光定量PCR对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测结果均为阴性，可用于饲料中沙门菌的检测。Yu等（2009）通过qPCR检测生物饲料发酵过程中多种致病菌的变化，结果发现添加益生菌发酵的固态饲料可以降低金黄色葡萄球菌、产毒大肠杆菌等致病菌的水平，且在整个发酵过程中都没有检测到沙门菌。此外，霉菌污染也是影响生物饲料适口性的重要因素，有研究表明，乳酸菌对产毒素霉菌的生长有抑制作用 （Dogi等，2015）。Nateghi等（2016）利用相对定量分析参与黄曲霉毒素生物合成调控的aflR基因，发现嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌对aflR基因的表达有抑制作用，证明了乳酸菌可以抑制寄生曲霉的生长并降低黄曲霉素的产量。已有研究应用qPCR对黄曲霉毒素水平与其决定基因表达量的相关性进行检测（Iheanacho等，2014），以期从基因水平预测饲料中黄曲霉毒素产量的潜在风险。微生物检测的传统方法需要选择性培养基、生物学特性及生化测定，其过程费力耗时，实时荧光定量PCR技术重复性好、定量准确，为快速鉴别诊断饲料中致病菌提供了有效的方法。

3.2 发酵饲料益生菌定量 由于发酵饲料成分比较复杂，在我国尚没有一个完善的发酵饲料品质评定体系。当前人们普遍认为益生菌活菌含量是评定发酵饲料品质的一项重要指标。传统检测发酵饲料益生菌含量的标准方法是平板计数法。由于部分乳酸菌也可以在有氧情况下生长，因此在涉及乳酸菌的发酵过程中，平板法会大大高估总需氧菌的数量，基于平板计数的微生物定量所提供的饲料质量信息是有限的 （Passoth等，2010），这些限制可以通过使用基于核酸序列比较与培养无关的分子技术来克服。Fibi等（2016）将qPCR分析方法用于鉴定肉鸡饲料中动物双歧杆菌，并通过抑制消减杂交技术获得其特异性序列，设计引物并构建相关标准曲线，其最低检测浓度为 2×101cfu/g。李婷婷（2019）通过 SYBR Green 染料动态检测了秸秆饲料发酵过程中发酵微生物的变化，该方法方便了双歧杆菌等厌氧细菌的检测。魏爱彬（2012）通过qPCR技术研究单一菌种及复合菌种发酵全价饲料过程中的菌群变化，结果发现，不同试验组菌群变化趋势存在差异，干酪乳杆菌、植物乳杆菌单一菌种发酵组在发酵3 d时达到最大值，后续发酵过程中菌量变化不明显，发酵10 d时活菌数均达到8.00 lg cfu/g以上；而复合菌种发酵组中干酪乳杆菌在发酵4 d达到峰值后持续下降，发酵10 d时为6.58 lg cfu/g，植物乳杆菌发酵2 d时活菌数最高，达9.31 lg cfu/g，之后无显著变化。种间竞争可能是导致饲料中微生物多样性下降的一个因素，能够适应发酵环境的微生物得以生存并形成优势（Yang等，2016）。同时在利用Ct值检测饲料中微生物时，应考虑处于VBNC状态下的细胞和死菌DNA对检测结果的影响。胡会龙等（2019）用EMA来消除死菌DNA扩增对结果造成的误差，将优化后的EMA处理条件用于发酵饲料中乳酸菌的检测，以乳酸菌16S rRNA为目标基因构建标准曲线，检测结果与平板计数具有较高的符合度。qPCR可以同时对多个样品进行检测，缩短了检测时间，在生产中应用可以极大地减少工作量，提高检测效率。目前只有少数研究报道利用qPCR技术监测发酵饲料发酵过程中微生物群的动态变化，因此，需要进一步研究qPCR技术定量检测发酵饲料接种益生菌的稳定性，结合pH与乳酸含量变化，为益生菌在生物饲料中的应用提供数据支持。

3.3 饲喂效果检测 随着生物饲料研究的逐渐深入，生物饲料对提高饲料利用率、改善畜禽肠道健康、提高畜产品品质等方面的作用需要进一步明确（蔡辉益，2019）。研究发现，酵母发酵饲料具有提高饲料消化率、动物生长性能和增强机体免疫功能等生物学作用（Carlson等，2003）；张棋炜等（2017）通过qPCR技术发现酵母发酵饲料能够显著提高瘤胃细菌总数并促进除牛链球菌以外的5种瘤胃功能细菌的生长繁殖。王梦芝等（2010）用荧光定量PCR技术研究了不同蛋白质饲料对嗜淀粉瘤胃杆菌生长的影响，结果表明豆粕蛋白饲料更利于嗜淀粉瘤胃杆菌的生长，其密度及数量在细菌总数中的比例最高。幼畜体内细菌生态系统的建立可能会影响其成年后肠道细菌的组成，从而影响消化效率，且幼畜初期的肠道微生物环境受母体消化菌群支配，优化母体的肠道菌群是增加幼畜肠道有益微生物的数量及活性的一种策略，Faubladier等（2013）利用qPCR检测小马驹体内纤维素降解菌的菌量变化，研究了产仔前后母马补充发酵饲料产品的影响。孙艳等（2017）利用相对定量检测白斑综合症病毒 （WSSV）刺激后，虾血淋巴中酚氧化酶原（proPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）的基因表达量，发现饲料中添加坚强芽孢杆菌活菌与溶藻弧菌可提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。因此，利用实时荧光定量PCR技术检测宿主肠道微生物和相关免疫基因表达量，可以有效检测生物饲料的饲喂效用。传统的基于培养的细菌学检测方法昂贵又冗长，好多菌体外也不容易同步培养，且会低估肠道菌群的多样性，以DNA为基础的实时荧光定量PCR技术为肠道微生物的研究提供了便利。

3.4 转基因成分检测 识别饲料基质中的作物是针对转基因生物筛选的重要一步，大豆、玉米、油菜、大米、棉花、甜菜、土豆等是重要的转基因材料来源。已有研究（Campos等，2018；Mbongolo等，2011）通过SYBR Green染料和TaqMan探针对动物饲料中的植物物种进行特异性检测，将此法与针对转基因元素的qPCR方法相结合，可以有效确定饲料中的转基因成分。花椰菜花叶病毒35S启动子（p35S）和胭脂碱合成酶终止子（tNOS）是迄今为止在商业转基因作物中最具代表性的通用重组元件。Barbau等（2010）采用SYBR Green荧光定量PCR技术检测p35S和tNOS核心元件，这种方法特异性好、灵敏度高，并适用于检测含有p35S或tNOS元素的低含量转基因材料。有些生物饲料中使用的转基因微生物携带抗生素耐药性（AMR）基因，由于基因水平转移机制可能导致病原体和肠道菌群通过摄入含有AMR基因的转基因微生物或相关重组DNA而获得AMR基因，因此通过qPCR检测AMR基因的存在，以防止生物饲料中此类转基因微生物DNA的意外污染（Fraiture等，2020）。生物饲料中转基因成分的使用一直是公众关注的焦点，qPCR技术可以对生物饲料中的转基因成分进行鉴定，并评估其对公众健康和环境的潜在风险。

4 实时荧光定量PCR在生物饲料中应用的注意事项

4.1 DNA提取 有效提取高质量DNA的方法是应用qPCR技术研究生物饲料的前提。DNA提取方法的选择对qPCR检测微生物数量有显著影响，DNA提取效率在细菌、真菌和原生动物群落之间存在差异，会导致这些种群被高估或低估，使用不同DNA提取方法获得的qPCR结果不一定具有可比性（Henderson等，2013）。由于生物饲料组分复杂，传统的提取纯培养微生物DNA的方法并不能完全适用，并且可能遗漏劣势微生物群体；发酵产物中所含的蛋白质和脂肪，会对其DNA提取效率产生一定影响，进而影响实验结果，如双歧杆菌、乳酸菌等革兰氏阳性菌的细胞壁结构通常需要特殊处理才能分解；在检测含有芽孢杆菌的样品时，由于从芽孢中直接提取DNA较为困难，可能需要额外的萌发步骤，因此选择合适的提取方法尤为重要。沈丽等（2012）采用磁珠法，加入裂解缓冲液和蛋白酶K，提取植物源性饲料中的核酸，并通过qPCR鉴定动物源性成分，结果发现磁珠核酸提取法的实验效果优于商品化核酸提取试剂盒。蛋白酶K处理法对酶的质量有很大的依赖性，应该避免蛋白酶K的长期储存对细胞裂解造成的影响。马俊孝等（2009）通过间接法提取青贮饲料中微生物总DNA，将样品用PBS缓冲液洗涤后收集菌体沉淀，通过溶菌酶、CTAB等试剂裂解细胞，并用异丙醇沉淀DNA，提取的DNA可直接用于下游分子实验。溶菌酶可以高效分解革兰氏阳性菌细胞壁中的肽聚糖，与EDTA联合使用时，对细菌细胞的破坏作用尤为显著（Abdulamir等，2010）。溶菌酶、RNase以及商业试剂盒中额外的蛋白质沉淀步骤，可以有效去除生物饲料中的PCR抑制物，提高DNA纯度，避免qPCR扩增反应失败和假阴性结果。直接对生物饲料中微生物总DNA进行分析，避免了预增菌、纯化培养等步骤，在一定程度上克服了传统培养法的弊端，且可以用来探究样品中微生物的多样性和动态变化情况。

4.2 靶序列选择 菌种对于生物饲料来说至关重要，是生物饲料的核心。生产过程中，常出现菌株来源不明、不纯和菌种退化等现象，因此我们首先要保证菌种的安全性，确保菌种及其产物对动物、人体及环境无害。实时荧光定量PCR技术通过测定目标基因数量来定量微生物种群，因此靶序列的选择尤为重要。以乳杆菌属为例，16S rRNA序列同源性分析已作为细菌分类鉴定的有力佐证，但是乳杆菌属分类复杂，16S rRNA基因序列同源性高，无法建立特异性高的引物和探针；如副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌亲缘关系较近，以groL、tuf和16S rRNA为目标基因设计的特异性引物会进行交叉扩增（Achilleos等，2013）。此外，由于16S rRNA基因可以在多个拷贝中存在，且在不同物种中16S rRNA基因拷贝存在差异，因此qPCR法计数的细菌群体中16S rRNA的拷贝数大多高于常规培养定量的数量（cfu）（Chaloemnon 等，2016）， 这导致样本中目标菌数量被高估，定量结果存在一定误差。研究表明 ，gyrB、recA、rpoD、hsp60 等 基 因 序 列 较 16S rRNA序列，可以更好地区分相似种，因此更适合用作引物设计的靶基因（杨小红等，2014）。陈臣等（2013）利用SMM系统筛选植物乳杆菌特异性序列，选择CAAX家族蛋白酶基因设计特异性引物进行qPCR检测，该引物对其他近源菌株均无相应扩增。同时有研究应用抑制消减杂交（SSH）鉴定基因组DNA片段，进行特异性引物的开发（Sattler等，2014）。除此之外，有些生物饲料涉及高温处理会导致DNA片段化，当扩增200 bp以上的目标序列时，很难获得可靠的结果，因此在DNA严重降解的饲料样品中，物种鉴定必须依赖于短DNA靶基因的扩增。随着许多物种全基因组测序的完成，可以通过生物信息学技术建立新的方法，从全基因组水平比较筛选出种内保守的物种特异性DNA序列作为靶基因，提高实验的准确性。

4.3 死菌和活菌的区分 生物饲料中活的益生菌才能在动物胃肠道中发挥其益生作用，由于实时荧光定量PCR不能区别活菌与死菌，因此有效的前处理步骤至关重要。EMA是一种核酸交联试剂，能够选择性地穿过细胞壁和细胞膜，在强光照射下与基因组DNA共价交联，使DNA形成沉淀，从而降低了DNA模板的可扩增性。尽管EMA可以有效减少来自死细胞的PCR信号，但它可以部分进入细胞膜完整的活细胞，诱导其基因组DNA的降解（Nam等，2011）。研究表明，可以用PMA替代EMA处理活细胞，PMA比EMA的电荷更多，使得PMA更难穿透完整的细胞膜，对活细胞的选择性更高且细胞毒性低，可以弥补EMA的不足，得到较好的检测效果（Yán～ez等，2011）。 将EMA或PMA与qPCR技术相结合，排除样本中死菌信号对实验结果的干扰，一定程度上克服了qPCR的不足之处，有利于生物饲料发酵微生物菌群变化的研究。

4.4 其他 实时荧光定量PCR在生物饲料的应用中，面临的一个常见问题是存在不可预测的扩增产物，如引物二聚体，在特异性靶基因较少的样品中最为明显，好的引物可以扩增单一的产物，其区别在于产生单一的熔解曲线峰，而不是产生非特异性产物，这对实时荧光定量PCR检测结果的准确性具有重要意义（Martín 等，2008）。 实时荧光定量PCR技术除了受样品DNA产量的影响外，还与样本中存在的细胞总数有关，例如在检测生物饲料中的动物蛋白源时，其结果可能根据组织类型的不同而变化。生物饲料是不同物种材料组成的混合物，检测时必须考虑交叉反应性以及所分析的样本类型，不同的样本类型具有不同的化学和结构组成，可以通过不同的机制抑制PCR反应，因此标准曲线在应用于不同的基质时是不准确的（Cocolin等，2011）。此外，发酵饲料中的微生物可能分布不均匀，如沙门氏菌被认为是传播不均匀的，即在饲料材料中聚集分布，通常情况下只有一小部分样品被检测出沙门氏菌阳性（Schelin等，2014），因此取样需要有代表性，要以合理的精度测量饲料中的微生物含量。

5 展望

生物饲料发酵过程中的菌群变化是影响饲料品质的重要因素之一，在以往生物饲料的研究中，多利用PCR-DGGE技术检测生物饲料发酵过程中微生物多样性的变化，分析群落中的优势种类（许爱清等，2010）。但生物发酵饲料的品质不仅取决于发酵微生物的存在，而主要取决于其数量，特别是发酵微生物初期，应以更可控、可预测的方式给产品提供特定的物质。实时荧光定量PCR具有定量、特异、灵敏快速、自动化程度高等特点，已广泛应用于医学、肠道菌群、酿造等领域的菌群变化检测分析，将其用于生物饲料发酵菌群变化的探究应得到重视，为生物饲料提供重要的检测工具。

然而实时荧光定量PCR也存在不足之处，使用单一靶基因进行qPCR检测的一个普遍限制是可能产生潜在的假阳性或阴性，因此建议使用多重荧光定量PCR，把多个遗传标记作为靶基因，使潜在的假阳性或假阴性结果最小化 （Yong等，2013）。在标准曲线定量中，定量标准物可以是cDNA、质粒DNA等，各个实验室所用的生成标准曲线的标准品各不相同；此外，由于PCR检测中的波动，不同PCR检测的Ct值无法直接比较。在相对定量中，其前提是假设内源控制物表达水平不受外界实验条件影响，选择合适的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。发酵菌株的规范化仍是生物饲料的研究核心，同一菌种的不同菌株其功能特性各异，需要进一步的研究来确定靶基因和qPCR检测方法，使其测定结果特异、定量准确。除了需要设计专门针对目标物种或菌株的引物外，qPCR还受DNA质量和产量的影响，基质中背景DNA的存在可能导致Ct值过高；微生物水平较低时，虽然富集步骤可以提高PCR检测效率，但会增加微生物的数量，造成计数的不准确（Ehrs等，2011）。为了比较不同的研究，饲料DNA提取和PCR扩增方法应该进一步标准化。若克服这些不足之处，实时荧光定量PCR技术在生物饲料领域将会有更加广阔的应用前景。