蛛网膜下腔出血后血肿代谢机制及治疗研究进展

周新建，赵金兵，余志强，朱云杨，马骏

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是指脑底部或表面血管破裂，血液进入蛛网膜下腔，引起一系列临床症状的急性出血性病变，占所有脑卒中的5%～10%。其中，颅内动脉瘤破裂是非创伤性SAH的首要原因(约占85%)[1]。SAH发生后，破入蛛网膜下腔的血肿及降解产物如血红蛋白、血红素、铁离子等具有很强的细胞毒性，其诱发的氧化应激、免疫炎症、凋亡、坏死及自噬等机制对神经元、内皮细胞等造成致死性损伤[2]。因此，蛛网膜下腔中血肿成分的清除与患者的预后密切相关。现对SAH血肿的成分及损伤、清除机制和相应的临床治疗靶点综述如下。

1 血肿的组成、代谢及损伤机制

动脉瘤破裂后，血液直接进入蛛网膜下腔形成血肿。红细胞降解后血红蛋白(hemoglobin，Hb)随之释放，进一步代谢为珠蛋白、血红素及铁。血红蛋白游离出红细胞时可大量消耗一氧化氮，可导致颅内小血管弥漫性痉挛并继而引起脑缺血损伤[3]。血红蛋白经氧化可生成高铁血红蛋白并分解出二聚体，随后降解产生血红素并释放铁离子；血红素在亚铁离子(Fe2+)和三价铁离子(Fe3+)结合状态下可以介导氧化反应，形成高活性的Fe4+。高铁血红素直接与脂质和蛋白质反应形成自由基，其产生的氧化反应及炎症级联反应可造成细胞膜、脂质、蛋白质和核酸的结构与功能的破坏[4]。此外，血红素可直接嵌入细胞膜，释放铁离子，对细胞造成致死性损伤。研究发现抑制血红蛋白或血红素损伤途径可显著增加神经细胞的存活率[5]。铁离子为血红蛋白代谢的终末产物，其大量增多导致铁依赖性脂质过氧化物的快速累积，诱发“铁死亡”[6]。总之，蛛网膜下腔中血红蛋白及其各级代谢产物是导致SAH后神经功能障碍的重要因素。

2 蛛网膜下腔出血后血肿代谢机制

SAH后血肿的代谢主要通过以下两个机制，一是通过内源性机制清除释放到蛛网膜下腔的红细胞及其降解产物；另一方面可以通过有创操作加快血肿的清除，减少蛛网膜下腔的血肿负荷。

2.1 内源性血肿代谢机制

2.1.1 红细胞的内吞 SAH早期，巨噬细胞/小胶质细胞活化为M1型及M2型细胞。M1型细胞大量表达Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)，通过激活TLR4-MyD88-NF-κB通路产生大量炎症因子，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子可以下调CD36在巨噬细胞中的表达。M2型细胞通过分泌CD36、白细胞介素(interleukin，IL)-10等来清除细胞碎片。CD36是巨噬细胞/小胶质细胞表达的一种膜蛋白，也是巨噬细胞和单核细胞上表达的Ⅱ型清除受体。巨噬细胞/小胶质细胞可通过CD36完成对异常红细胞的吞噬。有证据显示，在脑出血模型中，血肿及周围组织中CD36高表达组的血肿清除效率明显高于CD36低表达组[7]。

核转录相关因子2(nuclear transcription related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应原件信号通路是机体抗氧化的重要信号转导通路，选择性自噬接头蛋白P62(sequestosome-1)是一种选择性线粒体自噬受体，可降解泛素化底物蛋白。在机体自噬活动受到抑制时，P62大量聚集，在蛋白激酶的作用下与Keap1结合，释放Nrf2。SAH动物模型实验发现Nrf2可以上调CD36介导的噬红细胞作用[8]；而Nrf2等位基因的缺失降低了P62的表达并抑制红细胞的降解。因此，P62和Nrf2的相互作用是巨噬细胞发挥吞噬红细胞作用的一个重要调节机制。此外，PPARγ是一种编码Nrf2及其他抗氧化蛋白的转录激活因子，其通过增加小胶质细胞的吞噬活性和上调CD36来增强血肿代谢。

巨噬细胞表面的酪氨酸激酶AXL和MerTK通过连接蛋白GAS6和蛋白S与蛛网膜下腔的红细胞结合激活，促进巨噬细胞对异常红细胞的识别并启动内吞。在AXL/MerTK缺乏的小鼠SAH模型中，巨噬细胞的激活受限，与对照组相比，其对血肿的清除效率明显降低，神经功能障碍也较明显[9]；提示AXL/MerTK介导的巨噬细胞对红细胞的吞噬作用，在SAH后血肿清除和神经功能恢复具有重要作用。此外，AXL/MerTK的激活可抑制TLR信号通路、上调SOCS1和SOCS3的表达来触发巨噬细胞的抗炎作用，后者可促使AXL和MerTK蛋白从细胞膜上脱落成为可溶性受体，竞争性地结合GAS6和蛋白S，抑制巨噬细胞的吞噬功能，从而双相调节红细胞的内吞作用。

CD47是一种在细胞表面普遍表达的糖蛋白，其相应的配体为SIRPα，主要在巨噬细胞表达。CD47-SIRPα结合后传递出抑制信号，抑制巨噬细胞的吞噬活性。在衰老红细胞和血肿中的红细胞表面CD47的表达显著下降，其抵抗巨噬细胞吞噬的功能受到抑制，导致此类红细胞的清除增加。动物实验研究发现，对CD47的抑制可有效增加血肿内及血肿周围巨噬细胞的数量，增加血肿的清除，减轻脑肿胀及神经元的损伤[10]。

然而，SAH后大量红细胞负荷导致巨噬细胞参与的内吞机制快速饱和，巨噬细胞内的红细胞继续降解，其降解产物铁和血红素分别通过铁蛋白及FLVC受体1转运至细胞外。有研究显示40%的铁在巨噬细胞摄取红细胞后的24 h内被释放[7]。

2.1.2 血红蛋白的清除通路 蛛网膜下腔内未被吞噬的红细胞由于自由基及补体介导的攻击而发生溶解，血红蛋白自破裂的红细胞内释放并聚集在蛛网膜下腔。CD163是表达于单核细胞/巨噬细胞系的Ⅰ型膜蛋白，可促进巨噬细胞对游离血红蛋白的识别和吞噬。研究发现，CD163对触珠蛋白(haptoglobin，Hp)-血红蛋白复合物的亲和力比未结合血红蛋白高10倍。Hp是由一个或两个补体控制蛋白(complement control protein，CCP)结构域和一个c端丝氨酸蛋白酶(serine protease，SP)结构域的前蛋白，通过内质网中C1r-样蛋白在CCP和SP结构域之间剪切生成；其中SP结构域介导血红蛋白与CD163的结合，CCP区域决定Hp在血液中的集聚状态。内源性Hp主要由肝脏和网状内皮系统产生，正常状态下脑脊液的Hp水平远低于外周血液水平。在SAH等病理状态下，Hp可通过血-脑屏障(blood brain barrier，BBB)扩散至脑脊液内。Hp与血红蛋白结合后可稳定血红蛋白的活性铁及促氧化酪氨酸残基，减少其对脑组织的氧化反应；此外Hp与血红蛋白结合后其立体结构的改变，暴露出触珠蛋白β链的新表位，使巨噬细胞表面的CD163能够识别Hp-血红蛋白(Hp-Hb)复合物并启动内吞作用，清除游离血红蛋白[11]。

CD163的细胞外部分可溶性CD163(sCD36)也参与了SAH后Hp-Hb复合物的清除。对SAH患者的脑脊液检测分析发现，sCD163水平明显增高，一方面可增强CD163介导的Hp-Hb的清除，另一方面sCD163可与IgG、游离血红蛋白形成新的复合物，通过Fc-γ受体被巨噬细胞吞噬[12-13]。上述研究表明，Hp-Hb结合途径及CD163通路是SAH后血红蛋白清除的重要途径，在SAH中具有重要的保护作用。

2.1.3 血红素代谢途径 未被清除的血红蛋白进一步降解，其释放的血红素对中枢神经系统有损伤作用。血红素结合蛋白与血红素具有极高的亲和力，研究发现SAH后神经元和神经胶质细胞中血红素结合蛋白表达上调。表达于巨噬细胞表面的CD91是血红素结合蛋白-血红素复合物的内吞受体，是目前已知唯一的血红素清除蛋白。众多研究指出，SAH后CD91介导血红素-血红素结合蛋白复合物代谢通路是人体清除SAH后血肿代谢产物的重要途经[14]。

人体内存在HO-1及HO-2两种活性血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)亚型，其中HO-1主要在胶质细胞、巨噬细胞和内皮细胞中表达，而HO-2在包括神经元在内的大多数细胞中均匀表达。被内吞的血红素在HO的作用下，分解产生等量的铁、一氧化碳及胆绿素；胆绿素经胆绿素还原酶的作用进一步转化为胆红素。此外，胆绿素通过清除氧化自由基及脂质过氧化物抑制铁的过量释放；一氧化碳通过激活cGMP通路结合血红蛋白，减少血红蛋白对一氧化氮的消耗[15]。

2.1.4 代谢物铁的清除 机体内的铁转运主要是通过转铁蛋白(transferrin，Tf)。Tf主要在肝脏合成，但在中枢神经系统如少突胶质细胞中亦有高表达。铁-Tf-TfR途径是正常脑组织铁转运的主要通路。在SAH等病理状态下，脑组织的Tf及TfR表达上调，尤其是TfR在血-脑屏障的内皮细胞中表达上调，是脑内铁转运至血循环，降低脑内铁超载的重要途经。

铁调素(hepcidin,Hepc)是一种由肝脏合成并分泌的富含半胱氨酸的多肽，通过抑制细胞内铁的释放调节机体铁平衡。动物实验发现，SAH模型大鼠血清Hepc表达上调，同时脑脊液中以及小胶质细胞、神经元亦有高表达[16]；通过上调Hepc的表达，可抑制血红素诱导的乳酸脱氢酶释放，降低了细胞铁和铁蛋白的含量，同时抑制转铁蛋白受体1的表达，减少巨噬细胞内铁的释放，进而降低铁超载[17]。

2.1.5 脑血管周围间隙(virchow-robin space，VRS)通路 VRS是脑实质内穿支动脉、毛细血管和引流静脉周围的一个潜在腔隙，其内充满脑脊液，同时含有巨噬细胞和内皮细胞。目前认为，蛛网膜下腔的脑脊液可通过VRS在血管和胶质细胞间进行交换。有研究将少量的可溶性示踪剂注射到小鼠纹状体或海马体灰质后，发现示踪剂通过细胞外间隙扩散，而增加示踪剂的剂量后也未在脑实质内发现示踪剂滞留；这提示脑脊液内的物质可能通过VRS在整个脑血管中扩散。对脑卒中患者的研究发现，颅内微血管的收缩及脑组织弥漫性缺血会导致VRS的扩张及其内脑脊液量的明显增加，脑脊液通过VRS进入脑组织造成继发性脑水肿[18]。因此，VRS内的巨噬细胞及内皮细胞可能是一种潜在的血肿清除机制；可能是在SAH早期，血肿成分进入脑脊液并流入VRS，其中的凝血酶激活TNF-α转移酶，进而切割CD163产生sCD163，与血红蛋白形成复合物血红蛋白-sCD163，随后与IgG结合形成血红蛋白-sCD163-IgG复合物；后者可诱导邻近内皮细胞通过旁分泌上调HO-1，也可以自分泌途径激活FcγR通路诱发巨噬细胞对血红蛋白复合物的吞噬[19]。然而，VRS相关的血肿清除机制尚不完全清楚，还有待进一步的研究。

3 潜在治疗靶点

血肿及其代谢产物介导的毒性作用显著加重SAH后的继发性神经损伤，因而，如何减少血肿量及加快血肿代谢产物的清除，从而减轻相关脑损伤是SAH的一个研究重点。

3.1 促进红细胞的吞噬 研究发现，给予脑出血动物辛伐他汀、罗格列酮等PPARγ激动剂或维甲酸X受体激动剂贝罗沙汀，可上调血肿周边小胶质细胞表面CD36的表达，继而增强小胶质细胞对红细胞的吞噬作用[20-21]。此外，TLR4抑制剂TAK-242通过负调控TLR通路来上调巨噬细胞表面CD36的表达。通过增强CD36介导的血肿清除途径来促进血肿吸收，同时增加过氧化氢酶表达，降低过氧化氢的含量及其所致的氧化损伤。

另外，动物实验发现，抑制红细胞表面CD-47的表达可能促进巨噬细胞对异常红细胞的识别，增强血肿的代谢。已有临床试验证明CD-47抑制剂(TJC4等)可以增强机体对肿瘤细胞的杀伤作用[22]；因此其可作为潜在的加强血肿代谢的药物，但同时需避免对正常红细胞的损伤。

3.2 加速血红蛋白代谢 有研究发现，糖皮质激素可以诱导CD163的高表达，增强其与血红蛋白-Hp复合物的结合能力；然而，临床应用糖皮质激素并不能改善SAH患者的神经功能障碍及远期预后，甚至有增加应激性溃疡等并发症发生的风险[23]。SAH动物模型实验发现，Nrf2激动剂叔丁基对苯二酚可上调CD163表达，增强巨噬细胞的吞噬能力，加速血红蛋白降解，减少脑血管痉挛、脑积水及血-脑屏障渗漏等并发症[8]。

此外，外源性补充Hp可能是一个新的治疗方向。一项对心血管手术的研究发现，术中给予外源性Hp有助于减少术后因体外循环中产生的游离血红蛋白所致的急性肾损伤[24]。然而，人群中Hp1和Hp2等位基因的存在，以及Hp常染色体不完全显性遗传的特性导致提纯的Hp蛋白的免疫原性不同，存在一定免疫排斥反应。目前缺乏对触珠蛋白表型的快速检测方法，因此直接补充触珠蛋白用于SAH的治疗尚待进一步的研究。

3.3 增强血红素的分解 动物实验研究表明，CD91激动剂TLR7通过激活CD91-巨噬细胞通路，增强对血红素的代谢，从而对脑组织起到保护作用[25]。此外，在临床前研究中亦发现，鞘内注射CD91激动剂可促进血红素的清除[26]。HO是血红蛋白重要的代谢酶；在一系列SAH动物实验及小型临床研究中显示，TSG-6、miR-183-5p等HO-1激动剂可加强对血红素的清除，同时抑制NF-κB通路，减轻SAH后的早期炎症反应，从而对神经组织起到保护作用[27-29]。

3.4 铁代谢 铁作为血肿代谢的终末产物，可对神经元等细胞造成明显损伤。去铁胺作为一种铁螯合剂，可与血红蛋白分解释放的铁离子螯合，从而减少铁的病理性沉积。研究发现去铁胺可以通过血-脑屏障，延缓血肿内红细胞的降解和血红蛋白的释放；在脑出血动物模型实验中已证明去铁胺可以明显降低血肿及周围组织中的铁含量[22]。然而，在甲磺酸去铁胺治疗脑出血的二期临床试验中，与安慰剂组相比，治疗组患者在发病后90 d时并未表现出明显的神经功能改善，而在发病后180 d时的疗效评估有待进一步的分析验证[30]。

另外，予以SAH动物模型应用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)可以有效降低神经元的死亡，改善SAH的预后[6]。铁他汀作为另一种铁死亡特异性抑制剂，在脑出血的动物实验中也可减少神经元的坏死[31]；其机制可能是减少血红蛋白相关的铁沉积，降低了体内脂质活性氧的产生等。

4 结 论

SAH后红细胞弥散在蛛网膜下腔，其释放的血红蛋白、血红素及铁等一系列产物对脑组织产生继发性损伤，严重影响SAH患者的预后。机体可通过包括红细胞吞噬、CD163-Hp-Hb通路、CD91-血红素-血红素结合蛋白通路、血红素-HO机制、铁代谢等多种内源性途径清除血肿。然而，机体对血肿自发性清除的能力有限，目前尚无临床确切有效的药物可加快内源性血肿的清除。数种针对已有机制的药物如CD36、CD163或CD91激动剂、CD47抑制剂、TLR4抑制剂、去铁胺等在动物模型及小样本临床试验的应用取得了良好的效果。综上所述，SAH后的血肿代谢至关重要，是减轻脑损伤的重要机制，其深层次的代谢机制以及相应的治疗靶点仍需进一步研究。