miRNA调控自噬及其在胶质瘤中的作用

程丽霖，廖克曼，缪亦锋，陈炳宏，邱永明

胶质瘤是中枢神经系统(central nervous system，CNS)中最常见的原发性恶性肿瘤，占我国原发性脑肿瘤的29.78%[1],可以发生在中枢神经系统的任何部位，具有复杂的分子遗传特征，以及发病率高、恶性程度高、预后差的特点。尽管近年来，包括手术、放射治疗和化学治疗在内的多种治疗方法都取得了一定进展，但胶质瘤患者的预后仍然不令人满意。随着近年来分子生物学的发展和对胶质瘤病理生理过程的深入研究，分子靶向治疗逐渐受到关注。自噬是细胞内一种高度保守的分解代谢途径。在应激环境中，特定的细胞内成分，如受损的细胞器和有毒的蛋白质，被溶酶体定向降解，以维持细胞内环境的稳定。研究表明自噬在胶质瘤的发生发展中起重要作用[2-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小的单链非编码RNA[5]，其可以与mRNA的3′端非翻译区(untranslation region，UTR)结合，在转录后水平调节目的基因的表达，从而影响细胞的生物学行为。miRNA在自噬过程中起重要的调控作用[6]，进而影响肿瘤细胞的分化、凋亡、增殖、侵袭和转移，有望成为肿瘤治疗的新靶点。现对miRNA调控自噬及其在胶质瘤的作用研究进展综述如下。

1 自噬与胶质瘤

1.1 自噬的过程概述 自噬是一种被严密调控的细胞内成分自我降解再利用的方式，其过程可以分为以下几个阶段。(1)自噬的诱导：在饥饿、缺氧等应激损伤下，UNC-51样激酶1(UNC 51-like kinase 1，ULK1)活性增强，进而诱导自噬潮的产生；(2)自噬泡的形成：Beclin-1/磷脂酰肌醇3-激酶-Ⅲ(class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase，class Ⅲ PI3K)复合物招募自噬蛋白，形成自噬泡；(3)自噬泡的延伸：在轻链3(light chain 3，LC3)/自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG)8-磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)和ATG5-ATG12复合物的参与下，自噬泡的双层膜伸展扩张，LC3向自噬泡移动，将要被降解的胞浆成分包绕在自噬泡中；(4)自噬体的成熟：在多种ATG的作用下，待降解的胞浆成分被包绕在自噬泡中，自噬泡的膜结构闭合，形成自噬体；(5)自噬溶酶体的形成：自噬体通过胞内微管骨架运输至溶酶体，并与溶酶体进行融合形成自噬溶酶体，其内容物在溶酶体酶的作用下被降解，降解产物参与细胞的能量代谢过程。

1.2 自噬的双重作用 自噬对肿瘤生长起双重作用。一方面，自噬可以通过消除致癌蛋白底物、有毒的未折叠蛋白和受损的细胞器，减少炎症刺激和组织损伤，维持遗传信息的稳定从而抑制肿瘤[7]；另一方面，自噬可以参与细胞内物质的收集、降解和循环，为线粒体代谢提供底物，帮助产生ATP并维持能量稳态，提高了肿瘤细胞在饥饿、缺氧、生长因子缺乏等多种应激条件下的生存能力[8]，从而支持肿瘤的生长、侵袭和转移。

中枢神经系统中的细胞在应激压力下通过两种途径进行自噬调节：细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)途径和PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)/P70核糖体蛋白质S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K )途径[9-10]。研究表明ERK1/2途径对细胞自噬有正向调节作用，而PI3K/AKT/mTOR/P70S6K有负向调节作用[10-11]。胶质瘤中的自噬同样分为细胞保护性和细胞毒性两种。当细胞内毒性产物的浓度足以克服自噬所维持的细胞稳态时，细胞保护性自噬将转化为细胞毒性自噬。广泛应用于胶质瘤临床治疗的放射疗法和替莫唑胺(temozolomide，TMZ)疗法，都可以在提高肿瘤细胞保护性自噬水平的同时，诱导其发生自噬性死亡。

2 miRNA调控胶质瘤自噬

2.1 miRNA调控的保护性自噬 miRNA对自噬的调控作用几乎贯穿了自噬发生的全过程，其作用机制复杂，涉及多条信号转导通路。miRNA作为上游基因的靶点，将遗传信息靶向传递给下游的mRNA，在转录后水平调节基因的表达，影响肿瘤的生物学行为。血液供应不足和缺氧是几乎所有实体肿瘤微环境的共同特征[12-13]，肿瘤细胞面对的生存压力远大于正常组织，自噬是肿瘤细胞存活的重要机制。在胶质瘤细胞中，miRNA可以通过多条信号转导通路在自噬的不同阶段发挥调控作用，为胶质瘤细胞提供能量的同时，还可以清除受损蛋白，从而提高细胞在恶劣代谢环境下的存活率，促进肿瘤的发生发展。

研究发现，miR-384可以在胶质瘤细胞的自噬诱导阶段发挥调控作用[14]。其可以被上游的长链非编码RNA(RNA long non-coding RNA，lncRNA)人肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)直接吸附，负向调控高尔基膜蛋白1(golgi membrane protein 1，GOLM1)的表达。GOLM1影响AKT/mTOR通路相关蛋白表达，敲低GOLM1基因能够抑制胶质瘤细胞的自噬。与正常脑组织相比，胶质瘤中MALAT1的含量显著增加，miR-384含量降低，GOLM1表达水平升高，通过一系列的信号转导过程最终导致ULK1的表达水平上调，促进自噬的启动[14]。

miR-101、miR-224-3p和miR-454-3p则参与调控自噬体的形成阶段。miR-101是MALAT1的另一个作用靶点，与miR-384类似，受MALAT1吸附作用的影响，在胶质瘤中的含量降低，通过调控下游RAB5A(RAS癌基因家族成员)、微管解聚蛋白1(Stathmin 1，STMN1)和ATG4D的表达影响自噬泡膜结构的延伸，从微管动力学方面促进自噬体的形成，提高自噬活性，进而刺激胶质瘤细胞的增殖并阻断其凋亡[15]。miR-224-3p则受低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)负向调控，在胶质瘤中表达水平显著下调。ATG5受miR-224-3p负向调控，在肿瘤细胞中的表达增加。由ATG12-ATG5-ATG16组成的多体复合物定位于自噬泡的外膜表面，参与了自噬泡的延伸[16]。miR-454-3p可以靶向作用于ATG12，从而影响自噬泡的扩张能力，两者表达水平呈负相关。在胶质瘤组织中，miR-454-3p含量较正常脑组织明显降低，ATG表达上升，细胞自噬活性增高[17]。

同一种miRNA对自噬的调控并不局限于单一的通路。miR-93可以同时抑制BECN1/Beclin-1、ATG5、ATG4B和AQATM1/p62等多种自噬调节因子的活性，从而影响胶质瘤干细胞的自噬活性[18]。不仅如此，其还可以通过PI3K/AKT/mTOR介导的信号通路调控胶质瘤细胞的自噬水平[19]。这说明同一种miRNA可以通过多种作用机制发挥其对自噬的调控作用。

这些调控细胞保护性自噬过程的miRNAs可能成为胶质瘤治疗中的潜在靶点，通过靶向阻断自噬的激活，达到杀伤肿瘤细胞的目的，对提高肿瘤细胞对治疗的敏感性也有巨大潜力。

2.2 miRNA调控的细胞毒性自噬 自噬在肿瘤发生发展的不同阶段发挥不同的作用。肿瘤微环境中长期存在的应激会导致自噬性的细胞死亡[20]。虽然自噬诱导细胞死亡的具体机制仍有待研究，但普遍认为自噬的程度与细胞内损伤程度成正比[21-22]。自噬还可以通过清除受损细胞器、分解突变蛋白质抑制肿瘤细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。miRNA对细胞毒性自噬的调控作用可以发生在自噬的不同阶段。

在自噬的诱导阶段，胶质瘤细胞中过表达的miR-494-3p可以通过靶向下调PTEN基因的表达水平，激活下游AKT/mTOR信号通路，对细胞毒性自噬起抑制作用，促进肿瘤增殖和迁移[23]。miR-494抑制剂在体外实验中可以促进肿瘤细胞的程序性死亡，在胶质瘤临床治疗方面具有巨大潜力。

miRNA簇(miRNA cluster，MC)let-7家族是一类已知的肿瘤抑制因子，参与调控自噬泡的形成。胶质瘤组织中miR-let-7a-1、let-7d、let-7f的表达水平明显低于正常脑组织。信号转导与转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription1，STAT1)是miR-let-7d、let-7a-1和let-7f-1的重要靶基因之一，在胶质瘤中表达上调。上调的STAT3可以激活B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、髓细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)等凋亡调控基因，通过影响Beclin-1干扰ULK1诱导下的自噬泡成核过程，从而抑制细胞毒性自噬。体外实验中也证实，过表达MC-let-7a-1～let-7d可以加速胶质瘤细胞的自噬性死亡[24]。miR-449对自噬的调控也由Beclin-1介导，其能够与线粒体外膜的CDGSH铁硫结构域2(CDGSH iron sulfur domain 2，CISD2)结合；而CISD2可以通过CISD2/ MiR-449a /Beclin-1轴抑制自噬，促进胶质瘤细胞增殖[25]。

在自噬泡的延伸阶段，miR-770-5p和miR-24发挥重要调控作用。前者受lncRNA TPT1-AS1调控，在胶质瘤中表达水平下降，其下游靶基因STMN1表达水平上调，进而抑制细胞毒性自噬，促进肿瘤细胞增殖[26]。后者可以与β连环蛋白(β-catenin)相结合，影响ATG4A的表达，干扰自噬体的形成过程，抑制细胞毒性自噬，从而提高肿瘤细胞的活力[27]。在肿瘤发生发展的不同阶段，以特定的miRNA为靶点诱导细胞毒性自噬，可能是未来肿瘤治疗中的新方向。

3 miRNA调控自噬与胶质瘤治疗

3.1 miRNA调控自噬与肿瘤电场治疗 肿瘤电场治疗(tumor-treating fields，TTFs)是一种利用低强度电场治疗恶性肿瘤的新兴疗法，已被批准应用于复发性或新诊断的多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的治疗。Roger等发表在《美国医学会杂志》上的一项临床试验显示，与单独使用TMZ相比，TTFs联合TMZ疗法在提高了GBM患者存活率的同时，没有显现出严重的毒副作用[28]。然而TTFs抑制GBM进展的具体机制尚不明确。此前被广泛接受的理论认为，TTFs通过干扰纺锤体的组装，阻滞有丝分裂中后期，导致细胞凋亡[29]。2019年的一项研究发现，TTFs诱导GBM细胞产生自噬可能是治疗过程的关键[30]。这一细胞死亡途径由AKT2/mTor/p70S6K轴介导，而miR-29b参与了自噬过程中AKT2的表达调控。TTFs治疗上调了胶质瘤细胞中miR-29b的表达，负向调节AKT2在细胞中的含量，从而抑制GBM肿瘤的生长[31]。深入研究miRNA调控自噬及其在电场治疗胶质母细胞瘤中的作用机制，有助于提高TTFs的临床应用价值，目前相关领域尚有广阔的研究空间，等待更多的学者去探索。

3.2 miRNA调控自噬与化疗抵抗 TMZ是一种具有抗肿瘤活性的烷化剂，可以通过损伤肿瘤细胞DNA，引发细胞毒性和细胞凋亡[32]；目前广泛应用于胶质瘤的临床治疗。

TMZ可以激活细胞自噬，引起LC3-II/I、Beclin-1水平增高和p62水平降低。这一过程由多种miRNA调控，前面提到的miR-93就是其中之一。TMZ可以降低肿瘤细胞中miR-93的表达水平，进而刺激肿瘤细胞发生保护性自噬[20]，产生化疗抵抗。miR-193-5p也可以提高肿瘤细胞的自噬活性，通过癌症易感候选基因2(cancer susceptibility candidate 2，C-ASC 2)/miR-193-5p/mTOR轴诱导细胞保护性自噬，导致TMZ耐药[31]。与上述TMZ诱导胶质瘤细胞产生保护性自噬不同，TMZ可以通过上调miR-519a的表达水平，强化BCL-2/Beclin-1复合物的解离，从而促进肿瘤细胞发生细胞毒性自噬，提高肿瘤对药物的敏感性[33]。

这些研究为解决化疗抵抗问题提供了新的思路。在临床应用中，能否通过联合使用TMZ和miRNA抑制剂，靶向抑制肿瘤细胞对化疗药的保护性自噬；或是通过增强特异的内源性miRNA，恢复耐药细胞的细胞毒性自噬活性，从而克服化疗耐药，提高化疗疗效，改善患者预后。

3.3 miRNA调控自噬与放疗抵抗 放射治疗是胶质瘤治疗的重要手段。在经过放射治疗的胶质瘤细胞中可以观察到自噬现象，但是自噬对细胞具有保护性还是毒性作用尚无明确的结论[34]。胶质瘤对放射治疗的抵抗可能与miRNA调控的自噬过程相关。研究发现，放疗后血清中miR-17-5p的含量显著降低；miR-17-5p可以靶向作用于Beclin-1，负向调控细胞保护性自噬活性，使肿瘤细胞产生耐受[35]。另一项研究发现，miR-21过表达，可以激活AKT/mTOR通路抑制细胞自噬，是肿瘤细胞躲避放疗诱导细胞死亡的关键环节。靶向阻断miR-21可以提高肿瘤细胞的细胞毒性自噬能力，进而增强放疗敏感性[36]。

4 结 语

自噬作为一种代谢途径，在肿瘤的发生发展中起“双刃剑”的作用。一方面，自噬可以提高对外界压力的抵抗力，促进肿瘤细胞的增殖；另一方面，可以诱导肿瘤细胞发生程序性死亡。miRNA通过AKT/mTOR、ERK1/2等多条信号转导通路，影响Beclin-1、ULK1等自噬调节因子的活性和ATG12-ATG5-ATG-16、LC-3-PE等关键复合物的形成，在自噬诱导、自噬泡的形成和延伸、自噬体成熟等阶段发挥调控作用。寻找特异性调控胶质瘤细胞自噬的miRNA并对其进行早期干预，可能是克服化疗耐药和放射抵抗、降低患者复发率和死亡率的重要手段。基于miRNA调控自噬通路的分子靶向治疗应用前景广阔，值得进行更深入的研究。