气肿疽梭菌主要抗原及毒力因子的研究进展

张文璇 曲庭伟 方 程 金 鑫，2* 严昌国

1.延边大学农学院动物医学系，吉林延吉133000；2.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心/延边大学，吉林延吉133002；3.延边大学农学院动物科学系，吉林延吉133000

气肿疽梭菌是属于细菌纲，芽孢杆菌科，梭菌属的一种专性厌氧菌[1]，无荚膜，有鞭毛，在体内外均可形成芽孢，且芽孢可长期在土壤中生存，在自然界中分布广泛[2]。因其基因组与其他梭状芽孢杆菌相比较小，所以气肿疽梭菌一度被认为只感染反刍动物，一般是反刍动物食用被污染的饲草或水源，通过消化道创伤侵入机体，或经由机体深部外伤感染侵入。但在2007年，有报道显示该菌也可以导致人类气性坏疽[3]，严重情况可致死亡，该消息迅速引起众多学者对其进行深入研究。

经研究，现已发现气肿疽梭菌的4 种主要抗原和毒力因子在气肿疽发病过程中起着重要的作用，分别为细胞毒素A（CctA）、鞭毛蛋白（flagella）、神经氨酸酶（NanA）和透明质酸酶（nagH）。本文将主要对以上4 种抗原的相关研究进行总结概述，期望能为日后气肿疽检测方法和新型疫苗的研究提供参考。

1 细胞毒素A

细胞毒素A（CctA）是一种由Joachim Frey 及其团队经全基因序列分析发现的蛋白质毒素，其分子质量为33 ku，属于细菌毒素杀白细胞素超家族β-微孔形成毒素[4]，主要起到细胞毒性和溶血活性的作用。经系统发育进化树分析，细胞毒素A 与毒素β、毒素NetB 也有较近的亲缘关系，可以认为是梭状芽孢杆菌旁支出来的新亚科毒素[5-6]。

陈晓洁等[7]对其进行了蛋白结构域分析，发现该蛋白无跨膜区，有信号肽存在，并预测该蛋白有多个磷酸化位点，可能含有较多抗原表位，为找到其致病的分子机理提供了一定依据。

云巾宴等[8]建立了用于临床诊断的以气肿疽细菌毒素CctA 基因为基础的气肿疽聚合酶链式反应检测方法，是目前比较快速、高效的检测方法[9]。并在后续试验[2]中对几种气肿疽PCR 检测方法进行了比较，最终发现以CctA 为靶基因设计的引物最为敏感，其最小检测DNA 量为1.230×10-5pg/μL，为气肿疽病临床诊断提供了可靠技术手段。

张皓等[10]成功扩增了CctA 基因目的片段，并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。齐强[11]成功构建了能有效刺激小鼠的体液及细胞免疫应答的牛气肿疽CctA 基因核酸疫苗，在一定程度上增加了机体细胞免疫水平，为牛气肿疽基因CctA 核酸疫苗及免疫策略的研究奠定一定的基础。

2 鞭毛蛋白

鞭毛蛋白（flagella）分子质量为46 ku[12]，是气肿疽梭菌的一种重要抗原，也是引起气肿疽发病和生物体感染的最重要的毒力因子之一。鞭毛的作用主要是帮助菌体运动，促进感染在机体内的进一步扩散。

早在1994年，Mayumi 等[13]就发现气肿疽梭菌的鞭毛至少有3 个抗原决定簇。张永佳等[14]进行了气肿疽延边株FliA 基因真核表达载体的构建，综合Mattar 等[15]通过建立小鼠模型进行的研究，可知该基因在病原学检测和免疫学方面具有重要的意义[16]。另有试验[17]成功构建了重组克隆载体pMDl8-T FliA(c)，但需要注意的是，该方法构建克隆载体时，目的片段扩增时退火温度的筛选以及目的基因与pMDl8-T 连接的成功率仍不够理想[17]，进行下一步研究时可以考虑更换更为适合的PCR 方法，或者寻找更合适的载体。

3 唾液酸酶

唾液酸酶（NanA）也称神经氨酸酶，分子质量约为81 ku，是主要的毒力基因。经三级结构分析可知：有2 个凝血因子活力区[18]；有1 个唾液酸酶活力的糖苷水解酶家族[19]，4 个糖苷水解酶活力区；有1个类似半乳糖结合位点及刀豆蛋白样葡萄糖酶凝集素[20]。有研究显示[21]唾液酸酶能够水解寡糖、糖醛酸苷、糖蛋白和糖脂中的末端唾液酸残基和甘氨酸残基，从而影响细胞内基质[22]并能够破坏宿主免疫调节的通路[23-24]。

2011年，Vilei 等[25]在气肿疽的培养物中提取到了唾液酸酶。根据绿脓杆菌产生唾液酸酶帮助其在呼吸道上定殖的相关研究结果，有理由推测唾液酸酶在细菌感染和定殖过程中起到了重要作用。且气肿疽之所以具有发病迅速，病程短的特点，也很可能是因为唾液酸酶的作用[26]。2019年，马玉腾等[27]对该基因进行了真核表达载体的构建，同年张皓[23]在此基础上进行了小鼠免疫试验，结果显示该核酸疫苗能够明显使小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答，为该病的防控提供了新思路。

4 透明质酸酶

透明质酸酶是帮助细菌传播的重要毒力因子，可以分解透明质酸，帮助病原体从最初感染的部位移动到目标器官[28]。Frey 等[29]的研究发现了气肿疽梭菌的基因组有2 种不同的透明质酸酶基因，分别为nagH和nagJ，并证实了nagH的免疫活性。通过对透明质酸酶的克隆和序列分析得出，透明质酸酶参与了细胞内基质和连接组织的分解，加快了气肿疽梭菌及其代谢物质在受感染宿主机体内的传播。总体来说，目前对于气肿疽梭菌透明质酸酶的研究相对较少。