果蔬氧化还原防御系统研究进展

林少华，张晓军，张慧杰，贾红亮，潘 妍，罗红霞*

（1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

蔬菜和水果的营养丰富，是人类所需的维生素、矿物质和膳食纤维等许多重要营养素的主要来源，也是人们日常健康饮食的重要组成部分。全球每年的水果和蔬菜总产量很高，但是由于它们存在季节性、地区性及易腐性，采摘后仍然进行着旺盛的代谢活动，在目前贮藏能力不足、关键技术缺乏、产业体系不健全等情况下，果蔬自身极易衰老变质，并可能同时受到机械损伤、微生物侵染和冷害等威胁，降低了其食用品质和商品价值，从而限制了果蔬产业的发展。随着人们生活品质的不断提高，新鲜、健康、天然、营养的果蔬越来越受到人们的欢迎，需求量也越来越大，因此延缓果蔬衰老，抑制果蔬采后品质下降是农产品贮藏行业目前面临的最大挑战，而植物的氧化还原防御系统在调控果蔬衰老变质过程中起到了非常重要的作用，植物体内许多重要的细胞过程涉及氧化还原反应，如分解代谢/合成代谢、蛋白质构象的变化和应激等[1]。

在大多数需要氧气来维持生命的植物中，大部分生理代谢是依赖于氧化还原反应来进行细胞的能量生产、细胞增殖、细胞分化和凋亡等。而参与这些过程的氧化剂和还原剂有辅酶（NAD+/NADH，NADP+/NADPH）、硫醇（谷胱甘肽）和活性氧（超氧阴离子、过氧化氢）、抗坏血酸等物质[2]。尤其是作为还原剂的活性氧，对平衡植物氧化还原反应和调控逆境胁迫抗性有重大影响。有研究表明植物体的衰老劣变与活性氧（reactive oxygen species，ROS）的调节密切相关[3]。ROS 主要是指超氧阴离子自由基（O2-·）以及O2-衍生物质，它是植物生理代谢的必然产物。当ROS 的产生超过植物的氧化防御范围时，就会引起细胞损伤甚至死亡[4-5]。因此，清除果蔬体内的ROS 是保持水果新鲜度和提高抗氧化能力不可分割的一部分。植物活性氧水平受多种因素影响，外源因素包括污染、辐射、烟草、外源性物质，而内源因素主要是由活性氧代谢转化造成的。活性氧在多种组织细胞中产生，并与许多信号通路和相关酶反应[6]。因此，探究果蔬采后氧化还原防御系统的作用机制和ROS 代谢的调控机理对贮藏保鲜精准控制技术的研究有重要意义，对延长果蔬货架期、减少损失具有指导意义。

1 果蔬体内活性氧的产生及特点

活性氧（ROS）包括羟自由基（·OH）、超氧化物自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、脂类过氧化物（ROO·）和烷自由基（R·）等类型[7]，是细胞在生理代谢过程中产生的一类含氧的、化学性质活泼、存在时间短、氧化能力极强的代谢产物及其衍生物的总称[8]。植物细胞在生物和非生物胁迫下，如衰老、干燥、冷害、高温、病原微生物侵害等，在有氧呼吸和光合作用过程中通过O2的还原不断产生ROS[9]。目前已在叶绿体、过氧化物酶体、线粒体等细胞内以及植物细胞壁和质膜等细胞外两种途径中检测到ROS[10]。其中，细胞内叶绿体活性氧主要通过类囊体、叶绿体基质和黄素脱氢酶这3 个途径产生，线粒体则主要是在内膜上产生[11]。而在细胞外基质产生活性氧的主要途径是植物体内细胞质膜电子传递系统或质膜氧化还原系统。

研究表明，少量的ROS 在植物发育中具有重要的生理作用[12]，可作为信号转导分子控制细胞生长发育以及适应环境变化等一系列生理过程，并可作为细胞壁松懈剂[13-14]。然而，活性氧是植物在成熟衰老过程中产生的代谢副产物，是一类能够损伤细胞的毒性物质，过量的ROS 会引起氧化应激，导致蛋白质变性损伤和脂质过氧化以及DNA 损伤等多种不良反应，参与果实衰老的特殊线粒体蛋白已被确定为ROS 的作用靶点[15]。研究还发现，ROS 会提高果蔬的呼吸强度，降低维生素C、总糖等营养物质的含量，加速果肉软化及自溶，从而降低硬度，促进果皮褐变进程[16]，因此，ROS 的大量积累是造成果蔬衰老、品质下降的主要原因之一。用于检测细胞内ROS 含量的试剂有5-（和-6）-羧基-2’,7’-二氢二氟荧光素二乙酸酯（H2DFFDA）、二氢罗丹明甲酯（DHR123）、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）等。此外，基因编码荧光蛋白指示剂已被开发用于体内检测细胞ROS 的变化，但存在蛋白质表达困难、pH 敏感性强和细胞毒性大等缺点[17]。

2 果蔬的氧化还原防御系统及其作用机理

果蔬细胞中存在一套复杂完整的氧化还原防御系统（reduction oxidation system，redox-system），能够调节细胞的氧化还原状态。当植物体内产生ROS 时，会自动激活这套氧化还原防御体系，通过增加抗坏血酸和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）等抗氧化物质的含量[18]，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶的活性[19]，保护其不被ROS 损伤。这套系统包括酶促体系和非酶促体系[17]，当植物产生过多的ROS时，这两套体系将会协同作用清除ROS，进而维持ROS产生与清除系统的平衡[8]。然而，在非生物因子逆境胁迫下，如高温、机械损伤、病原菌侵染等，会干扰ROS-Redox 动态代谢平衡，导致ROS 的过度积累、相关内源抗氧化物质含量和ROS 清除酶活性下降，从而引起采后果蔬ROS 代谢失衡，进而加剧呼吸紊乱、生物膜功能丧失、能量供应不足等问题[20]，使采后果蔬品质劣变，严重影响其贮藏保鲜和销售[7]。

2.1 酶促抗氧化系统

2.1.1 作用机理

酶促抗氧化系统主要通过SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、POD 和谷胱甘肽S-转移酶（GST）等清除ROS[17,21]，因此，它们活性的高低对保持植物体内ROS 的平衡十分重要。

SOD 分布于叶绿体、线粒体、细胞溶质等多个部位，可以通过歧化反应将O2-·催化成毒性较低的H2O2和O2，阻止·OH 的合成，以清除超氧自由基，CAT 协同SOD 进一步将H2O2转化成为H2O 和O2，从而对氧化损伤起到防御作用[22]。CAT 和SOD 的协同催化反应在防御超氧自由基损伤方面起着至关重要的作用[23]。超氧化物歧化酶的活性部位含有铜、锌、锰三种不同金属离子，作为其功能的辅助因子。其中，铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）存在于细胞质、线粒体膜间隙和细胞核中，而锰超氧化物歧化酶（MnSOD）存在于线粒体基质中[24]。

POD 普遍存在于植物细胞内，含有一个Cys47 残基，可被过氧化氢、脂质过氧化物和过氧亚硝酸盐等过氧化物底物氧化成半胱氨酸磺酸（Cys-SOH），Cys-SOH 在另一种过氧化物酶中进一步与Cys47-SH 相互作用形成二硫键[25]，并被谷胱甘肽等供体还原[26]。POD 既能在催化过程中产生自由基，加剧组织氧化，又能通过催化与CAT 协作将低浓度的H2O2分解并清除。研究发现，POD 可减少细胞溶质和线粒体中约90%的H2O2[27]。

此外，APX 在抗坏血酸盐的作用下，通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环反应，可将抗坏血酸和H2O2转化为水和脱氢抗坏血酸，还可协助POD、CAT 和酚类将H2O2还原为水，从而清除体内的活性氧，缓解ROS 对机体的毒害作用[28]。GPX 作为一种含硒酶，在作为氢供体的条件下可以还原H2O2，维持细胞的正常生理功能[17]。GST 可以催化谷胱甘肽（GSH）与许多非极性小化合物（如醌类化合物）的结合，以抵御醌类化合物引起的氧化应激[29]，在GSH 作为辅助因子的情况下，能够将有机过氧化氢还原为醇，并在抗氧化防御系统中发挥重要作用[30]。低浓度ROS 可通过诱导脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的降解、防御信号分子的生物合成以及植物抗性基因的表达，在植物体内起到防御伤害的作用[31]。通常植物体内的第一道抗氧化防线以SOD 对于超氧阴离子的转化为主，第二道防线以CAT 和GPX 等酶的共同作用为主[10]。

2.1.2 果蔬酶促抗氧化的研究进展

活性氧在植物体内的爆发在果实成熟衰老过程中扮演着重要作用，过量的活性氧累积会引起果实衰老或凋亡。由此，果实自身在应对不同环境胁迫（冷害、病害、盐胁迫、机械损伤等）会进行相应的ROS 响应，通过酶促抗氧化系统发挥作用使细胞内的ROS 水平得以平衡，以维持采后果实品质[32]。大量研究表明，抗氧化剂系统能参与低温胁迫下水果中活性氧的调控。Yoshihiro 等[33]通过将李子存储在不同温度下发现，6 ℃时李子过氧化氢含量高于1 ℃，且总抗氧化能力（TAC）、SOD、CAT、APX 的活性较低，导致6 ℃的果实具有更大的氧化应激，从而冷害症状比在1 ℃下更为严重。Siboza 等[34]用茉莉酸甲酯（MJ）和水杨酸（SA）处理柠檬，可诱导其体内酶促抗氧化剂的产生来增强果实的耐寒性，CAT、APX 和GR 等抗氧化酶参与了对MJ 和SA 处理柠檬的耐寒性传递。这一研究结果与Araújo 等[35]的结果相似，CAT 和APX 活性降低造成了H2O2的积累，酶促应激诱导的CAT 和APX 活性增加在甘薯抑制H2O2含量中起着重要作用。

病害胁迫能够对果蔬酶类抗氧化剂活性产生影响，从而对ROS 的积累产生影响。部建雯等[36]发现核盘菌接种之后的黄瓜体内POD、SOD、APX 活性表达升高。王岳霞等[37]也认为青枯菌侵染茄子嫁接植株时，会使植株体内超氧阴离子和H2O2积累，从而引发酶促抗氧化清除系统中CAT、SOD、POD、PPO、APX 以及GR 等抗氧化酶的活性增强以抵御病原菌侵害。庞强强等[38]发现高温处理后的菜心体内MDA 含量显著升高，且POD、SOD、CAT等抗氧化酶的活性也增加，另外Mn-SOD、POD 和CAT基因表达量显著增加。Maurer等[39]研究发现紫外线（UV-C）照射处理能够促进葡萄的CAT、APX、GR 等抗氧化酶活性的提升，同时也提高了葡萄的抗氧化能力。陈存坤等[40]发现臭氧处理能诱导草莓的氧化防御系统，通过刺激酶促防御反应中重要抗氧化酶（SOD、CAT、APX）活性的提高来应对氧化胁迫，减少草莓中活性氧的积累。

2.2 非酶促抗氧化系统

植物体内的非酶促抗氧化系统主要是指具有还原性等生物活性的、能与活性氧发生一系列反应从而达到清除活性氧的物质[10]。

2.2.1 作用机理

非酶促抗氧化系统主要包括还原性谷胱甘肽（GSH）和抗坏血酸（ASA）等几十种化合物[7,17]。它们既可直接消除ROS，同时又可作为酶的底物在ROS清除中发挥作用[10]。植物体内重要的非酶类抗氧化物质主要是ASA 与GSH，它们能够在逆境胁迫过程中直接清除植物体内过量的·OH、O2-·和H2O2等活性氧物质，或通过ASA-GSH 循环途径的偶联反应将活性氧还原为水或醇等不易挥发的化合物[41-42]，以有效减少细胞内MDA 的积累，保护膜结构并修复自由基引起的氧化损伤，使植物在一定程度上抵抗逆境胁迫，从而延缓果蔬组织的衰老进程[7,43-45]。此外，谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸过氧化物酶的协同作用能够确保内源性谷胱甘肽和抗坏血酸在植物细胞内维持抗氧化系统高效运行所需的高水平[46]。抗坏血酸可通过降低MDA 的含量，抑制膜脂过氧化作用[22]。GSH 是细胞内主要的含巯基化合物，除了直接清除自由基之外，还可作为SOD、CAT 和APX 等抗氧化酶的辅助因子，保持蛋白质巯基处于还原状态，并再生抗坏血酸等抗氧化剂的活性形式[47]。因此，GSH 氧化是非生物胁迫的一个生化特征，其通过谷胱甘肽还原酶活性的再生在清除ROS 中起到非常重要的作用[42]。

2.2.2 果蔬非酶促抗氧化的研究进展

果蔬氧化还原防御系统不仅包括酶促反应，同时还存在非酶促反应。当活性氧的积累与代谢失衡造成果蔬衰老腐败时，非酶促反应在平衡氧化还原方面同样起重要作用，它通过与酶促反应的协同作用直接或间接达到清除过量活性氧的目的，使植物细胞内的活性氧产生和清除处于动态平衡。

抗坏血酸-谷胱甘肽循环（AsA-GSH）是近年来的研究热点，该循环对活性氧的清除有重要作用。特别是在CAT 不足的情况下，果蔬细胞中产生的H2O2主要是由ASA-GSH 循环清除[48]。Ali 等[49]研究发现经过臭氧熏蒸的番木瓜非酶促抗氧化系统中抗坏血酸、β-胡萝卜素、总酚含量增加，尤其是抗坏血酸。Hasan 等[50]发现外源性GSH 处理番茄能显著减少ROS 的积累、增加一氧化氮（NO） 和亚硝基硫醇（SNO） 的含量，并通过平衡ASA-GSH 循环，利用氧化还原机制刺激抗氧化系统，以此提高番茄对镉（Cd）胁迫的耐受性。Zhang 等[48]研究也发现臭氧处理可通过提高草莓ASA 和GSH 的累积提高超氧阴离子、过氧化氢的清除效率，维持采后草莓品质。此外，杨乾等[51]发现水杨酸处理诱导了采后甜瓜果实ASA和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的增加，从而抑制了丙二醛（MDA）的产生，清除过量的过氧化氢，有效防止了细胞膜脂过氧化。林艺芬[52]在用外源H2O2处理采后龙眼的研究中发现，H2O2促进果实果皮中抗氧化物质ASA、GSH、类黄酮与类胡萝卜素的降解，加速了采后O2-·产生速率和MDA 含量的上升，促进了ROS 的氧化爆发，最终导致果实和果皮褐变。胡花丽等[53]研究发现延缓猕猴桃的衰老机理与其维持果实较高的ASA 和GSH 有关，2%O2＋3%CO2气调处理有利于提高果实的ASA 和GSH 含量，清除O2-·产生速率和DPPH 自由基，有利于再建果实氧化还原的稳态，从而延缓猕猴桃的衰老进程。

3 保鲜技术对果蔬采后ROS 清除的影响

根据果蔬氧化还原防御系统的要求，只要能够清除果蔬ROS 或提升酶促或非酶促抗氧化体系，均能够减少采后果蔬的品质劣变，延长贮藏保鲜时间。近年来，国内外开发了许多安全且具有干预果蔬氧化还原防御系统功能的保鲜技术。如采用酸性氧化电位水对蓝莓进行处理后，能够调节ROS 代谢并减少其积累，提高SOD、CAT 和APX 的活性，从而降低果实腐烂率[54]。纳米复合包装材料也能减少ROS 的产生，抑制金针菇的呼吸作用和失重率、保持其货架品质[55]。臭氧（O3）已被证明在农产品储存方面发挥了积极的作用，能够降低O2-·和H2O2的含量，提高SOD、CAT、APX 及单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的活性，促进ASA 和GSH 的积累，改变相关抗氧化基因和蛋白的表达[56-57]。此外，外源ROS 清除剂、植物提取物和冰温贮藏等保鲜方法也能较好地减少ROS 的积累，改善果蔬的贮藏品质并延长贮藏时间。

4 结论与展望

果蔬的成熟和衰老过程与活性氧的积累有关，也与其体内许多重要的酶促和非酶促抗氧化体系有关。虽然这些体系可以使果蔬在成熟衰老初期保持氧化还原处于动态平衡状态，但在成熟衰老的代谢和结构分解过程中，果蔬仍会发生不可逆的氧化应激反应。因此，抗氧化化合物含量和抗氧化酶活性对延长果蔬贮藏期具有重要作用，对它们的调控研究已经成为国内外果蔬采后的重点和热点。近年来，通过臭氧、包装材料、天然植物提取物和冰温贮藏等果蔬采后品质控制技术，能够有效地控制活性氧的产生和积累，延缓果蔬的衰老变质，延长保鲜期和销售期。

随着分子生物学和检测技术的发展和成熟，果蔬氧化还原防御系统的研究方向主要有以下几点：通过进一步深入研究果蔬ROS 产生的机理及氧化还原防御系统的机制，从而开发出更多高效清除ROS、提高抗氧化活性的技术和方法；通过进一步探究果蔬不同处理对于触发抗氧化机制的共同点，解析果蔬氧化还原系统激活的调控因素；通过进一步开展采后领域果蔬的活性氧代谢与其生理品质之间的相互作用关系研究，为采后果蔬保鲜新技术的开发提供理论参考；通过开展多学科交叉探究ROS 代谢与果蔬衰老之间的关系，如分子生物学在果蔬逆境胁迫与ROS 代谢机制方面的系统研究和应用，将对果蔬采后贮藏保鲜具有重要意义。