不同光源对贮藏过程中大白菜脂肪含量的影响

刘思佳，田少楠，高兰兰，刘 耀，王拓一

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161000）

大白菜（Brassica ChinensisL.）属十字花科植物，是我国北方地区消费量和贮藏量最大的蔬菜品种之一[1]。大白菜在贮藏期间会出现萎缩、黄化、脱帮等现象，导致贮藏品质发生严重变化[2]。脂质是生物代谢过程中的重要物质，近年来有研究表明，脂质过氧化能够引起植物脂肪降解，致使细胞凋亡，最终导致植物衰老[3-4]。因此，研究大白菜贮藏期间脂肪含量变化以及相关基因的表达规律，对提高大白菜贮藏品质具有重要的意义。

LIP2和LOX2是大白菜脂肪代谢过程中的两个关键调控基因，在脂类氧化过程中起关键作用。LIP2是解脂耶氏酵母中最早发现的脂肪酶相关基因，该基因编码的蛋白含有334 个氨基酸，可以分泌到胞外，是一种胞外酶[5]。LOXs大量存在于动物、植物和微生物中[6]，在植物中主要分布于脂质体、微粒体等，同时在脂质体膜和质膜上也有发现[7-8]。LOX2是植物体内一类重要的同工酶，也是植物体内催化脂质降解的关键酶[9]，在整个植物生长过程中发挥着重要作用[10]。由于LOX2的反应产物可进一步产生自由基，对细胞膜具有一定的破坏作用，因此被认为是植物衰老的促进剂[11]。

光作为重要的环境因子，在植物的生长发育以及物质代谢中都起到了极其重要的作用。雷静等[12]在4 ℃贮藏樱桃番茄过程中采用LED 红蓝单色弱光照射樱桃番茄，结果发现，红蓝单色弱光能够延缓樱桃番茄衰老，保持营养成分；Jin 等[13]研究发现，LED 红光更有利于保持西兰花的品质，而LED 蓝光对西兰花的老化没有显著影响；Ma 等[14]发现LED 绿光照射延长了西兰花的货架期；田少楠等[15]研究发现，与白光贮藏条件相比，黑暗条件下LIP2和LOX2的表达量呈现上调趋势，而脂肪含量呈下降趋势。本文以大白菜为研究对象，分析了不同光源贮藏下LIP2和LOX2基因的表达规律以及脂肪含量变化，以期为大白菜贮藏技术的创新提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：大白菜品种为‘北京新三号’，购于黑龙江省齐齐哈尔市当地农贸市场。

试剂：38%Trizol，赛默飞世尔科技公司；三氯甲烷，天津市凯通化学试剂有限公司；99.7%无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂；99.7%异丙醇，天津市凯通化学试剂有限公司；36%～38%盐酸，辽宁泉瑞试剂有限公司；石油醚（30～60 ℃沸程），西安天茂化工有限公司；DEPC 处理水、DNA marker，上海生工生物工程有限公司；6×loading buffer，索莱宝公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII，TaKaRa公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit、5×Prime ScriptTMRT Master Mix，TaKaRa 公司；琼脂糖，苏州宇恒生物科技有限公司；Super Gel Red，博美生物科技有限公司；50×TAE缓冲溶液，北京康为世纪生物科技有限公司；RT-qPCR引物。

1.2 仪器与设备

JY 电泳仪，北京华威兴业科技有限公司；Quant Studio3 实时荧光定量PCR 仪，上海巴玖实业有限公司；FA2204C 电子天平，浙江赛德仪器设备有限公司；TD5Z冷冻离心机，盐城市凯特实验仪器有限公司；P70D20TJ-D3 微波炉，格兰仕微波炉电器有限公司；UV-3000 紫外分析仪，上海嘉鹏科技有限公司；HHS-11-2 数字恒温水浴锅，山东博科再生医学有限公司；101-1-BS 电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；自制光照保鲜柜。

1.3 试验方法

1.3.1 大白菜预处理

将采购的新鲜大白菜去除表面泥垢后，用保鲜膜密封，分别存入红、蓝、绿三层光照贮藏保鲜柜中，每层存放3 颗，红光强度范围245～465 lux，绿光强度范围1 972～3 457 lux，蓝光强度范围1 178～2 296 lux，保鲜柜温度设置为4 ℃。

1.3.2 大白菜总RNA 的提取

分别称取三种光照条件下贮藏的大白菜0.100 0 g，放入1.5 mL RNase-free EP 管中，分别在3 支EP 管中加入0.5 mL Trizol 试剂，冷金属浴上进行充分研磨。按照Trizol 法提取植物RNA 的方法提取大白菜RNA，将得到的RNA 室温干燥5～10 min 后，加入20 μL DEPC 处理水溶解，再进行电泳检测，紫外分光光度计测量RNA 浓度，并保存于-80 ℃。

1.3.3 cDNA 的合成

按照5×Prime ScriptTMRT Master Mix 3.5 μL、RNA 2 μL、ddH2O 4.5 μL 配置成10 μL 标准反应体系；混合均匀后离心，再进行cDNA 的合成。PCR 反应条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃无限循环，反应循环数为40 个；反转录合成的cDNA 稀释10 倍使用。

1.3.4 实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）分析

Real-time qPCR 反应体系包括5 μL TB-Green、0.5 μL P CR Forward Primer （10 μmol）、0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、3 μL ddH2O、1 μL 样品cDNA，构成总体积为10 μL 的反应体系。Real-time qPCR 反应条件为95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，40 个PCR 循环，采用默认设置自动生成Ct 值。每个样品设置3 个重复，用相对定量2-ΔΔCt法计算分析基因的表达水平。

1.3.5 基因引物序列

基因序列来自brassicadb.org，并利用NCBI-BLAST进行对比。基因引物序列获取自https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/primers，并利用NCBI-Primer-BLAST 进行验证[16]，引物序列表见表1。

1.3.6 大白菜脂肪提取与测定

参考GB 5009.6—2016 食品脂肪的检验方法测定大白菜的脂肪含量[17]，选择酸水解法进行操作[18]。

1.4 数据分析

数据分析采用SPSS 22.0 单因素方差分析（One Way ANOVA）。所有数据均采用平均值和标准方差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 大白菜中脂肪代谢基因在不同光源下的表达

2.1.1 大白菜中LIP2基因在不同光源下的表达

利用实时荧光定量PCR 方法，分析红光、蓝光、绿光贮藏条件下，大白菜LIP2基因的相对表达量，见图1。经过40 d 光照贮藏后，与贮藏初期相比，大白菜LIP2基因的表达量明显下降。研究表明，解脂耶氏酵母LIP2是一种更高效的脂肪酶，比活性远远大于其它脂肪酶[19]。方差分析表明，在贮藏初期，红、蓝、绿三种光源下LIP2基因的表达无显著差异，而贮藏40 d 后，LIP2基因的表达量在绿光下显著大于在红光和蓝光下的。LIP2基因的表达量高，脂肪酶的含量高，从而加快了脂质过氧化，导致脂肪含量降低。

图1 大白菜LIP2 基因在不同光源条件下的表达Fig.1 Expression of LIP2 gene in Chinese cabbage under different light sources

2.1.2 大白菜中LOX2基因在不同光源下的表达

有研究发现，TCX8通过与TCP20或TCP4结合LOX2启动子来调控LOX2的表达，从而影响茉莉酸的生物合成，延缓脂质的降解[20]。本试验利用实时荧光定量PCR 方法，分析了红光、蓝光、绿光贮藏条件下，大白菜LOX2基因的相对表达量，结果如图2 所示。由图可知，经过40 d 贮藏，与贮藏初期相比，大白菜LOX2基因的表达量明显下降。方差分析表明，贮藏初期，红、蓝、绿三种光照条件下LOX2基因的表达无显著差异；而贮藏40 d后，LOX2基因的表达量在绿光条件下显著大于在红光和蓝光条件下的。可见，LOX2基因的表达量低，能够延缓脂肪代谢，有利于脂肪的保持。

表1 引物序列表Table 1 List of primers

图2 大白菜LOX2 基因在不同光源条件下的表达Fig.2 Expression of LOX2 gene in Chinese cabbage under different light sources

2.2 大白菜贮藏过程中在不同光源下脂肪含量变化

由图3 可知，经过40 d 贮藏后，与贮藏初期相比，大白菜的脂肪含量明显下降。根据方差分析，贮藏初期，红、蓝、绿三种光照条件下大白菜的脂肪含量无显著差异。而贮藏40 d 后，脂肪含量在绿光条件下显著小于在红光和蓝光条件下的。LIP2和LOX2是大白菜脂肪代谢过程中的两个关键调控基因，LIP2和LOX2表达量越高，脂肪含量越低。经过40 d 贮藏后，LIP2和LOX2基因的表达量在绿光条件下显著大于在红光和蓝光下的（图1、2），而绿光贮藏条件下，脂肪含量降低的幅度更大，可见红光、蓝光更有利于大白菜贮藏过程中脂肪的保持。

图3 大白菜在不同光源条件下的脂肪含量Fig.3 Fat content in Chinese cabbage under different light sources

3 结论与讨论

有研究发现，LIP2 蛋白和胰脂肪酶一样，可以使三酰基甘油骨架的外部位置sn-1 和sn-3 处的酯键水解，LIP2 蛋白还可以从三酰基甘油分子中生成一个2-甘油单酸酯，并释放2 个脂肪酸[19]。LOX 蛋白能够催化游离的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化自由基，导致细胞损伤，引起机体代谢紊乱[3]。可见LIP2和LOX2两个基因与脂肪代谢非常相关。

本研究结果表明，经过40 d 的光照贮藏，与绿光相比，在红光和蓝光贮藏条件下，大白菜的LIP2和LOX2基因表达量明显降低，脂肪代谢水平较低。因此，在红光和蓝光贮藏条件下，大白菜的总脂肪含量可以保持较高水平。但是红光和蓝光哪种更适合大白菜脂类物质的保持，还有待于进一步研究。总之，用红光和蓝光对大白菜进行贮藏，有利于大白菜脂肪的保持，也有利于延长大白菜的货架期，提高大白菜的贮藏品质。