循环肿瘤细胞在胰腺癌诊疗中的应用

程浩，仇毓东

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一种预后极差的消化系统恶性肿瘤，2020年全球癌症数据显示：PC的死亡病例数与新发病例数相当［1］。2021年最新数据显示，其5年生存率仅为10%［2，3］。但一组来自日本的研究数据显示，小于2 cm的Ia期PC预后良好，5年生存率可达到68.7%，原位癌的5年生存率更是高达85.8%［4］。因此，提高早期诊断率对于改善PC不良预后至关重要［5］。另一方面，即使接受了根治性切除，许多PC患者仍然死于术后早期复发和转移，可能的原因是术前评估没有办法确定是否已经存在微转移病灶［6］。当前，PC的术前可切除性主要根据影像学，迫切需要研发真正的生物学指标［7］。近年来，以化疗为主的系统治疗、辅助治疗以及新辅助治疗水平的进步在改善PC预后中发挥了重要的作用［8-10］。但目前仍缺乏合适的生物标志物来评估疗效，指导方案的优化。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）作为从原发灶或转移灶进入血循环的少量肿瘤细胞，在包括PC在内的多种肿瘤的早期诊断、预后评估、疗效监测等方面受到了广泛的关注［11］。本文拟对CTCs在PC精准诊疗中的作用及意义，做一个系统综述和评价。

1 CTCs与PC的早期诊断

PC起病隐匿，早期诊断十分困难［12］。影像学和血清标志物是临床上最常用的诊断工具［13］。当前，PC的早期诊断尚缺乏有效的生物标志物。血清CA19-9有较高的敏感性，但其在多种非PC的疾病中均会有升高（如胃肠道肿瘤、合并黄疸的胆道疾病等）。约10%的患者因Lewis抗原阴性而不表达CA19-9，因此单独依靠CA19-9对于PC早期诊断价值有限［14-16］。

近年来，CTCs在PC早期诊断中的价值日益受到重视。Rhim等［17］在PC癌前病变（导管内上皮内瘤变，PanIn）的小鼠外周血中已经可以检测到单个突变细胞。随后的临床验证性研究中发现［18］，33%胰腺导管内乳头状肿瘤（intraductal papillary mucinous neoplasms，IPMN）和黏液性囊腺瘤（mucinous cystic neoplasm，MCN）患者的外周血中可检测到CTCs，73%胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者的外周血中可检测到CTCs。而正常对照组健康受试者的外周血中均未检测到CTCs。Liu等［19］对95例PDAC患者和48例健康患者的外周血进行CTCs检测，结果显示PDAC患者的CTCs总数和亚型的数目均显著增加，CTCs亚型在PC早期诊断中的潜在价值。Ankeny等［20］对72例确诊为PDAC患者的外周血进行CTCs检测，其中54例检测到了CTCs（敏感性为75.0%，特异性为96.4%）。Sefrioui等［21］发现CTCs诊断胰腺良恶性疾病的敏感性和特异性分别为67%和80%，而当CTCs联合CA19-9时，敏感性和特异性可提高到78%和91%，表明CTCs联合其它标志物可用于PC的早期诊断。Wei等［22］也发现Vimentin阳性的CTCs联合CA19-9可提供良好的PC诊断效能，受试者曲线下面积可达到0.968。而笔者所在中心的研究也得出了类似的结果［23］。尽管缺乏更大样本的前瞻性研究，但现有的结果已经证实了CTCs作为新型诊断标志物应用于临床的可行性。

2 CTCs与PC的疗效监测

当前，新辅助化疗和辅助化疗在PC的综合治疗中发挥着重要的作用。随着CTCs富集及检测技术的不断进步，于PC患者化疗前后检测CTCs，可以从细胞水平进行实时评价，动态地监测肿瘤的进展和药物的疗效［24］。在一项PDAC的PDX小鼠随机接受安慰剂或磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂BKM120治疗的临床前研究中，BKM120组治疗后CTCs计数下降明显且与肿瘤生长抑制相关，而安慰剂组则无明显变化。表明CTCs可作为一种较为理想的监测治疗反应的生物标志物［25］。一项前瞻性的临床研究纳入了37例接受吉西他滨联合白蛋白紫杉醇化疗的晚期PDAC患者，在治疗前、后两个月以及疾病进展时富集外周血CTCs，并检测其基因表达结果显示治疗后SMAD4的表达上调提示更好的治疗效果以及更长的无进展生存期［26］。Wei等［22］检测了患者采用改良的FOLFIRINOX方案或者吉西他滨联合白蛋白紫杉醇化疗前后的外周血CTCs，结果显示肿瘤缩小或稳定的患者CTCs计数下降或保持不变，而肿瘤进展患者的CTCs计数并没有下降，提示CTCs可监测化疗疗效。Ren等［27］比较了41例Ⅲ、Ⅳ期PDAC患者经5-FU化疗前后外周血CTCs的差异，结果显示治疗后CTCs的检出率和数目均明显下降，并可以检测到凋亡的CTCs，提示凋亡的CTCs可预示PC的化疗疗效。对于PC新辅助和转化治疗中，常规的影像学检查只能对原发病灶进行评估，而不能反映全身肿瘤负荷的变化，然而通过动态监测CTCs，有望对化疗疗效进行监测，从而确定最佳手术时间［28］。

3 CTCs与PC的预后评估

CTCs是从原发肿瘤组织进入血循环的肿瘤细胞，少数的CTCs可以导致微转移，极少数的CTCs最终可以形成转移病灶，因此CTCs可作为PC预后评估和复发监测的潜在生物标志物［29］。Court等［30］采用微流控纳米技术检测CTCs，并研究其在预后评估中的价值，结果显示24.5%的可切除PC患者术中发现了隐匿性转移灶。术前CTCs可有效诊断隐匿性转移灶患者，且与术后无复发生存率相关。Song等［31］在一项前瞻性研究中发现，对于可切除PDAC术前外周血中CTCs计数少于1个的患者总生存期（overall survival，OS）可达到35.5个月，而1个以上CTCs的患者只有16个月，提示CTCs计数可作为可切除PDAC的生存预后指标。最新的一项荟萃分析纳入了19项研究和1320例患者，结果显示CTCs阳性PC患者的OS和无进展生存期（progression free survival，PFS）均明显缩短，以检测方法、治疗方法和TNM分期进行的亚组分析可得出同样的结果［32］。循环肿瘤微栓子（circulating tumor microemoli，CTM）是CTCs的聚集体，与CTCs相比有着不同的表型和分子特征，表现出了更高的转移潜能。因此，同样可成为一种新的预后标志物［33］。一项纳入63例PDAC患者的前瞻性研究中，81%患者的外周血中检测到CTM。预后分析显示治疗前CTM数量是PDAC患者PFS和OS的独立预测因子［34］。Wu等［35］同样发现对于可切除PDAC，术前外周血中存在CTM提示预后不良，建议对此类患者进行术前评估时应全面考虑。

除计数之外，CTCs的表型和分子生物特征同样可作为预测生存的标志物。在表型方面，上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是一种表型改变，表现为上皮特征的丧失和侵袭性间质属性的获得，与肿瘤细胞的扩散有关［36］。EMT是一个动态的过程，促进肿瘤细胞从原发肿瘤组织脱落并进入血液循环系统［37］。因此，EMT现象使得PC的CTCs主要分为上皮表型和间质表型两种亚型。有研究显示，这两种亚型的CTCs具备不同的分子生物学特征，与临床预后的关系也不尽相同［38］。Poruk［39］等收集50例PDAC患者术前的外周和门静脉血样，先通过ISET系统富集CTCs，再通过免疫荧光法区分出cytokeratin阳性（上皮表型）和vimentin阳性（间质表型）的CTCs，结果显示39例患者CTCs cytokeratin阳性。其中26例同时表达vimentin，cytokeratin阳性的CTCs提示患者生存期较短，是生存预后的重要独立预测因子，vimentin和cytokeratin均为阳性的CTCs与术后较短的复发时间有关。因此，在运用CTCs评价预后时，应考虑CTCs的EMT现象，既不能仅分析上皮表型的CTCs，还应考虑间质表型的CTCs。而在分子生物特征方面，Amantini［40］等富集了20例局部晚期或转移性PC患者化疗前后的CTCs并采用数字PCR技术对CTCs进行基因表达谱分析，结果显示以ALCAM、POU5F1B和SMO mRNAs高表达为特征的患者PFS和OS更短。Sergeant［41］等从10名手术PDAC患者中富集CTCs，RNA双线性扩增后进行全基因组芯片分析，结果发现CTCs中表达率最高的是参与肿瘤细胞迁移的p38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信号通路，而与细胞运动相关基因的高表达与OS和无病生存期（disease-free survival，DFS）相关。Poruk［42］等首先通过免疫荧光法鉴定表达cytokeratin、CD133、CD44和ALDH等不同表型的CTCs结果发现ALDH阳性、三重阳性（cytokeratin、CD133和CD44）和双重阳性（cytokeratin和CD133）是肿瘤复发的独立预测因子，并与DFS降低相关。

肝脏是PC最常见的转移和术后复发的部位，而肝转移也是导致PC预后较差的重要原因之一［43］。门静脉直接回流胰腺的静脉血至肝脏，理论上CTCs在门静脉血中更易被检出，可作为预测PC患者肝转移和术后生存的潜在标志物［44］。White［45］等在一项前瞻性的临床研究中，对于可切除PDAC患者于术前收集外周血以及肿瘤切除前后分别收集门静脉血进行CTCs检测，结果发现门静脉血中的CTCs与患者术后的OS明显相关，门静脉血中未检测到CTCs的患者术后18个月的总生存率可达到100%。Tao［46］等同样发现基于流式细胞术检测的门静脉血CTCs可预测PC或壶腹部周围癌术后肝转移。随着超声内镜技术的进步，门静脉血CTCs的检测进一步得到了推广应用。2015年的一项单中心的队列研究中，超声内镜技术已被证实应用于门静脉血的采集以进行CTCs检测是安全可行的，患者并无相关并发症的发生［47］。最新的一项研究表明，经超声内镜获得门静脉血检测的CTCs是胰胆管癌患者PFS和OS的显著预测因子（cut-off值为185 CTCs/7.5 mL）［48］。而门静脉血中CTCs的高数量和高活性则被证实与门静脉血的免疫环境有关。Arnoletti［49］等发现，与外周血相比，PDAC手术前后的门静脉血中CTCs均具有更高水平的KRASmut mRNA表达，且在肿瘤切除后并无明显变化，同时门静脉血中的免疫抑制细胞亚群（M-MDSC）数量也高于外周血。而CTCs数量也与K-RASmut mRNA表达和M-MDSC水平呈正相关，提示门静脉血中免疫抑制环境可能促进CTCs的存活。该团队进一步发现，门静脉血中分离的CTCs经体外培养7天后，PDAC患者的CTCs招募了多种免疫细胞类型以形成椭圆形簇，并可促进CTCs的存活、生长。表明CTCs在门静脉循环中的存活可能是由于它们与多细胞类型簇中的免疫细胞相互作用，同时多细胞类型簇可能代表局部复发和转移进展的载体［50］。

CTCs作为“液体活检”的重要组成部分，近年来受到越来越多的关注和重视，其对PC的早期诊断、疗效监测及预后评估都有着显著的临床价值。随着检测技术的进步，将来有望利用循环血实时检测CTCs来替代肿瘤组织活检。且微量组织基因组和转录组测序技术的进步也使对CTCs的认识也从简单的数量鉴定提高到对分子特征的研究。但目前CTCs在临床上的推广应用仍需对富集、检测方法的标准性和功能性分析的可靠性进行更加深入和细致的探究，同时需要大样本的前瞻性研究进行验证。