数字PCR技术在玉米及其产品中转基因成分检测中的应用

付海滨李修平林 森付 伟刘二龙张明哲朱鹏宇

(1.沈阳海关技术中心,辽宁 沈阳 110016; 2.济宁海关综合技术服务中心,山东 济宁 272200; 3.中国检验检疫科学研究院,北京 100029; 4.黄埔海关技术中心,广东 广州 510730; 5.浙江省检验检疫科学技术研究院,浙江 杭州 310012)

2019年是转基因作物商业化的种植的第24年,全球转基因作物栽培种植面积发展很快,截止2019年全球转基因作物栽培面积约1.904亿hm2,比1996年增长了约112倍,在过去23年(1996～2018年)中,累计种植面积达27亿hm2,转基因作物为全球带来的经济效益达2 249亿美元。目前,玉米是获批转化体数量最多的农作物(已有35个国家/地区批准了146个转化体),仅2019年全球种植的转基因作物中就有6 090万hm2种植了转基因玉米;按单种作物的种植面积计算,2019年全球31%的种植玉米是转基因玉米。转基因玉米种植面积美国最大,2019年美国种植转基因玉米达3 317万hm2,巴西位居第二,种植转基因玉米1 630万hm2,阿根廷位居第三,种植转基因玉米590万hm2[1]。虽然我国批准了进口转基因玉米用于饲料加工,但目前仍未批准转基因玉米的种植[2]。然而,随着全球转基因作物栽培面积的不断增长,转基因作物带来了人们对其生态环境和食品安全问题的担忧。目前,很多国家对转基因产品进行标识管理并设定了转基因含量阀值,如欧盟设定食品和饲料中转基因成分阀值为0.9%[3],澳大利亚、新西兰、以色列等国家设定的阀值为1%,智利的阀值是2%,韩国、马来西亚设定的阀值为3%,日本、泰国、印尼等国家设定的阀值为5%[4～6]。我国高度重视转基因农作物及其加工产品的安全问题,目前我国对转基因产品的监管要求最严格,实行“零容忍”。基于阀值的要求,可靠、稳定、精确的转基因定量检测技术已成为转基因产品检测方法研究的热点,是转基因产品安全监管和标识管理的重要技术支撑。

目前对玉米及其产品中转基因成分检测方法主要有两类,一类是基于外源核酸的转基因检测技术,包括PCR电泳法、多重PCR法、实时荧光PCR法、等温扩增技术、基因芯片技术、数字PCR等;一类是以特定的表达蛋白为目标物的检测方法,包括酶联免疫吸附技术、SDS聚丙烯凝胶电泳分析技术、蛋白质氨基酸序列飞行时间质谱分析方法、蛋白芯片技术等[6～7],基于核酸序列的PCR检测方法是目前食品中转基因成分检测的主要技术。

数字PCR技术是继常规PCR和实时荧光定量PCR之后,近年来迅速发展起来的一种全新的核酸检测定量分析技术[8～9]。和荧光定量PCR相比,数字PCR不依赖扩增曲线和标准曲线就可以实现绝对定量分析,且定量结果不受PCR扩增效率影响,准确度高、重现性好,因此,数字PCR具有比普通PCR和实时荧光PCR定量技术无法比拟的优越性,在转基因产品定量检测领域具有极大的应用前景[10～13]。目前,数字PCR技术已应用到玉米及其产品中转基因成分定量检测中[14～15]。

1 数字PCR技术的基本原理

数字PCR (digital PCR,dPCR)的概念是1999年由Vogelstein等提出的[16],数字PCR技术是一种基于泊松分布原理的针对单分子目标DNA的绝对定量技术[17],dPCR不需要对每个循环进行实时荧光测定,也不需要Ct值来定量靶标。dPCR先是将样品大量稀释等量均分到相互隔离的大量微小的反应单元中,每个反应单元作为一个独立的PCR反应器,其中含有或不含待检靶标分子(DNA或RNA),在PCR扩增结束之后,在荧光下显示荧光(含待测核酸分子,表示为“1”),或没有荧光(不含待测核酸分子,表示为“0”),最后根据泊松分布原理计算待检靶标分子的浓度或拷贝数(图1)。目前,商业化的数字PCR仪可以分为两大类:一是基于微流控芯片数字PCR仪,二是基于油包水技术的微滴数字PCR平台。

2 数字PCR技术在玉米及其产品中转基因成分检测中的应用

近年来,很多学者利用不同的数字PCR技术平台,开展了玉米及其产品中转基因成分检测技术研究。Corbisier等(2010)最先将数字PCR技术应用在转基因成分的定量检测中,分析了转基因玉米种子MON810品系中外源基因和内标准基因的拷贝数比,分析结果与以质粒DNA为标准物质的荧光定量PCR检测结果一致,证实了数字PCR技术的可靠性[18]。Dobnik等(2015)建立了转基因玉米微滴数字PCR多重定量检测方法,完成了对DAS1507、DAS59122等多个转基因玉米品系的多重定量检测分析,该方法可满足国际标准中对转基因成分定量检测的要求[19]。Fu等基于筛选元件的无预处理dPCR检测方法,以CaMV35s启动子和NOS终止子作为筛选元件,用微滴数字PCR和微孔数字PCR对转基因玉米品系MON810、MON863、TC 1507、MIR604、MIR162等进行定量检测,建立了拷贝数含量和质量含量的线性关系,并对结果的重复性进行了实验室内和实验室间的评估,结果表明,在无预处理的情况下,2种数字PCR检出限均达到0.1%, CaMV35s和NOS元件在转基因作物的出现概率分别为65.7%和53.49%,组合后可覆盖81.4%的转基因农作物,即该方法可覆盖大多数转基因作物[14]。Zhu等也使用相同的方法,用双重数字PCR开展7种转基因玉米品系的检测[20]。潘广等(2016)通过建立的转基因玉米品系GA21二重数字PCR方法测定了不同质量含量的标准品拷贝数百分含量[21]。潘广等(2016)基于微滴式数字PCR平台研究建立了一种在同一个微滴反应体系中同时测定转基因玉米品系T25中两种靶序列的双重微滴式数字PCR定量方法,灵敏度实验结果表明,在定量结果精度保持在RSD≤25%时可以检测到4.6个T25特异性边界序列分子[15]。胡佳莹等(2016)基于QuantStudioTM 3D 数字PCR平台,建立了转基因玉米MON863品系的单重和双重数字PCR定量分析方法,并与传统的qRT PCR结果进行了比较,结果表明,相比qRT-PCR,数字PCR能够实现真正意义上的绝对定量,更加适合用于转基因产品的含量分析[22]。姜志军等(2016)利用微滴数字PCR技术对转基因玉米种外源基因G23V-EPSPS拷贝数进行了检测分析,证实ddPCR具有较高的灵敏度和精确性[23]。王犇等(2017)建立了微滴式数字PCR检测方法,并分析了整合到转基因玉米中的外源基因(EPSP)的拷贝数,该方法与实时荧光定量PCR检测方法的结果一致[24]。张佳玲等(2017)利用建立了转基因玉米品系VCO-01981-5二重微滴式数字PCR定量检测方法,在定量结果相对标准偏差不大于25%时,可定量5个copies的该品系特异性序列分子和4个 copies的内源基因分子;而在50 ng模板DNA以下,PCR反应模板量与测定样品拷贝数之间呈高度正相关,相关系数R2达0.99以上,平均误差小于10%[25]。周圆等(2018)基于微滴式数字PCR平台,建立了TC1507、MIR162、MIR604转基因玉米品系的二重微滴式数字PCR检测方法,定量限可达10 pg或2～16 copies目标序列[26]。梁文等(2019)利用微滴数字PCR技术对转基因玉米品系MON89034、MON810、MIR162设计引物探针进行dPCR定量检测,通过多对引物探针组合,并筛选最优引物探针浓度、退火温度、PCR反应过程的时间、温度等,建立一套完整的转基因玉米dPCR定量检测方法,该方法的定量限为0.1%,转基因定量检测范围覆盖0.1%～100%,线性系数为0.999,精密度优于10%,该方法可以同时应用到市面上最常用微滴dPCR平台和3D芯片dPCR平台,且两种方法定量结果一致性好,该方法快速高效,在检测结果的准确度、稳定性优于传统的qPCR[27]。马丽侠等(2020)利用转基因玉米MON863质粒DNA建立了转基因玉米MON863质粒DNA双重微滴式数字PCR( ddPCR)的定值方法,优化了引物探针浓度,退火温度等条件,结果表明,外源基因MON863在1.6～6743.3 copies和内源基因Adh在1.1～6770 copies的浓度范围均呈线性关系,相关系数R2为1;MON863基因和Adh基因的定量限分别为8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%,采用该方法对基体标准物质进行验证,误差小于10%,该方法每个反应体系都含有内源(VIC)和外源(FAM)基因,能实现内外源基因的同时检测,避免同一样品在不同反应体系造成的定值差异[28]。梁美丹等(2020)基于双重微滴数字PCR平台建立转基因玉米Bt11品系及内源基因定量检测方法,结果表明,单位体系内源和外源基因拷贝数在DNA浓度为0.05～10 ng/μl时呈现良好的线性,相关系数R2为0.999;内源和外源基因的定量低限分别为11.14和3.96 copies,定量准确度试验结果显示相对标准偏差在5.68%～10.31%之间,满足小于25%的要求[29]。杨镇州等(2020)针对基于RNAi技术的转基因玉米品系DBN11061,研究并建立了一套逆转录芯片式数字PCR (dPCR)定量检侧该品系玉米双链RNA的方法,该方法的绝对定量限为2.5 copies/μl,RSD为12.4%;检侧低浓度实际样品达21.7 copies/μl,相对偏差为2.7%,RSD为14.6%,满足国际上转基因定量结果RSD小于25%的要求[30]。

我国在利用数字PCR技术开展转基因成分定量检测方面取得了突出成果,已制定了转基因产品数字PCR检测方法的标准,目前有2项国家标准和2项出人境检验检疫行业标准颁布,可以指导玉米及其产品转基因成分的数字PCR定量检测。国家标准GB/T 33526-2017《转基因植物产品数字PCR检测方法》针对玉米、大豆等转基因植物的通用筛选原件CaMV35s启动子和NOS终止子建立了数字PCR检测方法,定量检测限为0.1%(质量分数)[31]。国家标准GB/T 38132-2019《转基因植物品系定量检测数字PCR法》,该标准可采用微滴数字PCR反应体系定量检测物理加工种子样品中转基因玉米MON810、MON89034、 MIR162,定量检测限为0.1%(质量分数)[32]。出入境检验检疫行业标准SN/T4993-2017《转基因玉米检测 微滴式数字PCR定量法》则覆盖了对15种转基因玉米品系的检测,对30 ng玉米基因组DNA的检测低限为0.1%,150 ng玉米基因组DNA的检测低限为0.02%[33]。出入境检验检疫行业标准SN/T 5334.3-2020《转基因植物产品的数字PCR检测方法 第3部分:转基因玉米》对转基因玉米及其产品的数字PCR定量检测方法做了更为全面的规范[34]。

3 问题与展望

我国转基因玉米受限于政策原因,虽然目前在国内还没有放开种植,但我国每年进口大量的转基因玉米用于饲料生产加工。转基因玉米及其产品的安全是关系粮食安全和食品安全的重要问题,因此,各国政府都十分重视转基因产品监管和检测,为此,世界各国纷纷加强转基因产品的快速、高灵敏度、精准检测技术研究。近几年,数字PCR技术发展迅猛,目前市场上Bio-Rad、ThermoFisher等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品,主要有Bio-rad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系统、ThermoFisher公司的QuantStudioTm 3D dPCR系统、中国锐讯生物公司DropX-2000、小海龟BioDigital以及法国StillaTechnologies公司等,但目前数字PCR仪及其配套耗材的价格比较昂贵,限制了其广泛的推广,同时需要进一步制定并形成一批转基因成分数字PCR检测技术标准,在我国转基因产品监管实验室推广应用。今后,高通量、自动化、微型化、低成本、高灵敏度、高特异性、精准高效的转基因数字PCR定量检测技术成为转基因成分检测技术研究与应用的发展方向。