非洲猪瘟疫苗研究的困境和展望

陈芳洲，杨华威，赵祖凯

（武汉天种畜牧有限责任公司，湖北 武汉 430344）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）于1921年首次被报道，是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪只急性、热性、出血性、高度接触性传染病，临床感染猪只的死亡率可以高达100%[1]。临床上，ASF主要被分为3种类型：强毒力、中等毒力和低毒力类型[2]。强毒力类型的猪只主要引起发烧、食欲不振、精神萎靡、呼吸困难、皮肤充血、甚至死亡；低毒力毒株的ASFV可引起猪只间歇或者持续的病毒血症，引起皮肤坏死和关节炎等[3]。根据ASFV的P72蛋白的B646L基因的序列，最少有24种基因型的ASFV毒株已经被鉴定。

1921年，ASF首先在非洲肯尼亚被报道，这也是其名字的由来。1921年，在东非肯尼亚首次确认ASF疫情。之后在非洲呈现地方流行，1957年首次传入欧洲葡萄牙，1971年传入美洲古巴，1978年传播到意大利。2007年，首次传播至欧亚接壤的格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯，并在高加索地区呈现地方流行。2012年传入乌克兰，2013年传入白俄罗斯。2014年传入欧盟的立陶宛、波兰、拉脱维亚、爱沙尼亚，2016年传入摩尔多瓦，2017年传入捷克，罗马尼亚。2018年8月我国辽宁首次确诊ASF疫情。我国流行的主要是基因II型的ASFV毒株，据文献和行业的报道，我国猪场存在其他类型的ASFV毒株的流行。

针对ASF的灭活疫苗研制道路似乎走不通。从免疫保护的角度来说，减毒活疫苗的研制似乎是一条可行的道路，但是其潜在的散毒和在临床中持续感染的风险，严重地影响其商品化进程。亚单位疫苗，特别是联合多种亚单位进行联合使用，重组活载体疫苗，DNA疫苗都显示了一定的可行性，但是目前仍然都存在非常多的问题。复制缺陷单周期病毒这条道路解决了减毒活疫苗安全性的疑虑，是一条值得尝试的ASF疫苗研发道路。

1 ASF疫苗研究的困难点

从1921年首次被报道，一百年以来，各国科学家不懈地探索ASF的疫苗研制。尽管很多不同类型的候选疫苗展示了一定的可行性。截至目前，还没有任何一种商业化的ASF疫苗。

哪些因素限制了ASF疫苗的研制呢？

病原本身的特性：1）ASFV的基因组非常大，为170～193 kb，病毒粒子直径约200 nm，编码150～167个基因；2）这些基因与毒力及免疫相关的功能，以及多个基因之间协同互作的复杂情况还不太清楚；3）ASFV毒株变异性大，目前对其中和抗体的了解还不清晰，依据其VP72蛋白基因B646L，将其分为24个基因型；4）ASFV难以在体外培养系统稳定快速生长。

病原和宿主的互作：1）强毒ASFV常导致易感动物的快速死亡，因此很难研究病原和宿主相互作用关系；2）临床常见紧急使用的灭活疫苗失效，导致疫情进一步的扩大；3）目前对ASFV感染后是否产生中和抗体还存在争议；4）宿主的免疫保护机制还不明确，难以针对性地设计疫苗；5）不同毒株之间的交叉保护性差，ASFV基因型也多，候选疫苗的应用谱有限；6）缺乏良好的体外疫苗免疫效果评估动物模型；7）常见的减毒活疫苗免疫攻毒实验的持续期较短，对候选减毒活疫苗的持续感染排毒，以及对猪只的副作用研究较少；8）疫苗的毒株匹配性、使用剂量、接种途径、接种动物的特点等还未明确；9）未注册非法减毒活疫苗的使用，在临床容易转变为慢性感染，导致临床猪群副反应，严重危害行业，增加了大家对ASF疫苗安全性的担忧。

2 ASF理想疫苗的标准

被报道一百年以来，尚未研制出合格的商业化疫苗；一些欧洲国家，例如西班牙，历经了使用实验性疫苗导致疫情进一步恶化，之后通过不使用疫苗，成功净化了ASF，这也是目前OIE所提倡的方式；我国通过创造性的定点清除策略成功处置ASFV强毒株的案例；未注册非法弱毒疫苗给临床造成了巨大的损失，都让我们思考：理想的ASF疫苗的关键点是什么？

1）安全性是第一位的 疫苗的安全包括对免疫猪只的个体，和通过垂直和水平传播等对猪群的安全性；同时不仅是疫苗对猪只的健康的影响（持续感染和副作用等），也需要考虑疫苗对猪只种用质量、销售价格、生产性能等方面的综合影响；

2）有效性 包含对整个免疫猪群不同猪只的免疫保护性，同时需要考虑免疫谱，特别是针对异源毒株的免疫保护性；最好能具有同时激发体液免疫和细胞免疫的能力；

3）可区分免疫和感染状态 区分猪群免疫还是感染状态非常重要，可通过特异性的病原PCR或者抗体ELISA等方法对猪群感染情况进行区分；

4）在满足GMP要求的高质量的疫苗制品厂生产 一方面能保证疫苗质量持续稳定生产，且能避免疫苗外排毒风险；另一方面，需要稳定的病毒体外培养系统，能低价稳定生产；

5）跨动物物种的疫苗适用性不仅要能用于家猪，如果能同时用于野猪等，有助于ASF防控的简化。

3 不同类型ASF疫苗的研究现状

3.1 灭活疫苗路线基本走不通

20世纪30年代，人们就开展了ASF灭活疫苗的研制。

20世纪里，猪只器官、器官分泌物、戊二醛固定的感染细胞等通过加热和/或化学试剂灭活的方式，开展了ASF灭活疫苗的研制，结果是没有保护、部分保护、不能保护异源毒株攻毒等情况。

2014年，Blome等人[4]，2021年，Cadenas-Fernández等人[5]，开展了类似的以BEI（二乙烯亚胺）灭活病毒之后加入不同佐剂的灭活疫苗的研制，这些实验表明这些候选灭活疫苗甚至不能保护同源毒株对猪只的攻毒。因此，对ASF灭活疫苗的研制似乎走入了死胡同。

3.2 减毒活疫苗似乎是最有希望的，但其安全隐患引起了巨大的争议

20世纪30年代人们就开展减毒活疫苗的研究。减毒活疫苗的种类主要分为3种：通过人工体外传代的方式获得的减毒活疫苗、临床中发现的自然减毒活疫苗以及通过基因工程技术人工制备的减毒活疫苗。

3.2.1自然缺失弱毒疫苗的研究

2001年开始，很多科学研究中报道了能对同源强毒攻毒起到100%保护力的自然缺失减毒活疫苗，能引起免疫动物高水平的细胞免疫，同时副作用是体温升高、皮肤溃烂、关节肿等。

2004年Boinas等报道了来源于蜱虫的NH/P68毒株能对同源毒株的攻毒起到良好的保护作用或者延迟疾病的发生[6]。

2017年Gallardo等人报道了从拉脱维亚野猪中分离的自然缺失弱毒株Lv17/WB/Rie1能有效地保护家猪[7]。Barasona等人的后续报道中，该毒株经口服途径能保护野猪，但是该研究中还有很多地方需要进一步的评估，比如安全性、给药剂量、遗传稳定性以及动物长期排毒的特征等[8]。

欧盟的VACDIVA （H2020 Gran ID：862874）项目中也正在评估第3种自然缺失减毒毒株的免疫保护力，同时配套了检测免疫和感染状态的试剂盒，这一项目呈现出一些希望，但还在继续评估中。

3.2.2传代减毒疫苗的研究

1957年第一次报道免疫了细胞传代减毒的ASF疫苗可以部分保护经受同源毒株攻毒的猪只，但是因为幸存猪只少，使后续对抗体的特点研究和研制很困难[9]。

1963年，葡萄牙和西班牙的科学家使用不同传代方式的减毒活疫苗进行免疫攻毒实验，2个实验的结果都表明，只能起到部分保护作用，死亡率是变化的，而且会引起一定的副反应，比如皮肤溃烂、神经或者肺部系统的损伤等。同时一些免疫动物持续带毒，变成了这些弱毒株病毒的载体，并进行散毒。

细胞传代减毒弱毒苗的研制在持续进行中，尽管这些疫苗也展现出一定的保护力，但是，2017年，Titov等也报道了这些毒株会引起康复猪只血液和器官中持续数周的排毒情况[10]。同时，即使抵御住攻毒的猪只，28 d后仍然可能表现出临床症状，其安全稳定性值得持续关注。

3.2.3基因工程缺失疫苗的研究

伴随着基因工程技术的不断发展，针对ASF的基因缺失疫苗的研究非常多，成为21世纪以来主要的ASF疫苗研究方向。因为对于ASFV不同基因的毒力和免疫保护特性的研究还不太清晰，因此这些研究中尝试了不同的缺失形式：不同基因的单缺失疫苗研制、双基因或者多基因的联合缺失等形式，这些疫苗候选毒株的保护力差异巨大，从17%到100%不同。基因缺失毒株表现出非常好的保护力潜质，我国的哈尔滨兽医所研究团队也报道了7基因缺失ASFV毒株在动物实验中的良好免疫保护作用[11]。

但是伴随着各种减毒活疫苗的应用，都有一个非常重要的安全性问题，就是减毒活疫苗可能会造成持续的感染情况，以及引起猪只的副作用，比如皮肤溃烂、关节炎，导致神经系统、呼吸系统的损伤等问题。

近来FAO和路透社也报道了未注册非法弱毒苗引起临床慢性感染情况，甚至导致急性感染，对生猪行业造成巨大的损失，为ASF疫苗的研制，特别是减毒活疫苗的研制蒙上了巨大的阴影。

3.3 亚单位疫苗的研制还有较长的路需要走

20世纪90年代，人们开展了不同类型的亚单位疫苗的研制，杆状病毒表达系统为常用的表达系统。1995年，VP12蛋白，1998年VP54和VP30分别被用于表达亚单位疫苗的研制，不幸的是，这些实验中候选的亚单位疫苗免疫猪只后，无法抵御致死剂量ASFV的攻毒。2001年开始，常见的VP30、VP54、VP72和CD2v等蛋白被单独或者混合用于ASF的免疫；除了常见的杆状病毒表达系统，哺乳细胞，病毒载体也用于ASFV的亚单位蛋白的表达。

ASF的免疫攻毒实验结果表明，整体来说，目前亚单位疫苗不能保护猪只或者只能部分保护猪只，还有较长的道路需要走。

3.4 其他类型的疫苗研究还需要不断探索

其他类型的ASF疫苗主要包含DNA疫苗和/或载体疫苗、复制缺陷单周期病毒等。

载体疫苗主要依托腺病毒系统和杆状病毒系统，这些疫苗中都可以诱导产生抗体，但是只有少部分的候选疫苗表现出攻毒保护力，保护力从20%到100%不等。不同载体疫苗的混合使用可能是未来DNA疫苗和/或载体疫苗的一个重大研究方向。2020年，Goatley等报道了8种载体抗原混合候选疫苗能对于中等毒力ASF的攻毒提供100%的保护力[12]。

复制缺陷单周期病毒借助辅助细胞表达缺失的蛋白，相较于ASF减毒活疫苗解决了安全性问题或降低安全性风险。单周期病毒原位复制，但是不进行病毒组装。该技术已经被用于裂谷热病毒、流感病毒、蓝舌病毒、腺病毒等病毒复制缺陷单周期病毒的研究，且被证明有一定的免疫原性和保护原性，不仅能引起体液免疫，也能引起细胞免疫。因为相对于减毒活疫苗的安全性，该疫苗研制策略可作为一种ASF疫苗研制的方向。同时复制缺陷基因的确定，能稳定生产的辅助表达细胞体系的构建，都是构建复制缺陷单基因病毒需要解决的关键问题。

4 我国非洲猪瘟的防控

目前看来，我国ASF防控是一场持久战，且处于战略相持阶段。根据农业农村部的报告和行业信息，目前ASF在我国呈现地方流行性。全国各地也都在推进ASF“无疫小区”的建设和申报。

ASF给我国生猪产业带来了极大的损失。同时，ASF疫情也深刻地促进了我国生猪产业的发展，特别是对人员团队的建设，生物安全制度的深入人心，新的养殖防疫制度的升级，甚至是行业结构的深远变革。

1）ASFV基因II型野毒株的临床感染的防控 我国智慧的养猪人创造性地提出了精准剔除的猪场ASFV基因II型野毒株净化方案，不仅在临床中得到了广泛有效的应用，而且得到了国际同行的认可和尊敬，我国养猪人已经从最开始的向国外学习ASF防控技术的“小学生”到现在有了非常大的提升，而且有很多的技术突破。

2）临床弱毒株感染的防控 我国临床中已经鉴定了不同类型的ASFV弱毒株，FAO和路透社也报道了临床未注册非法疫苗的使用。因为临床假弱毒苗的复杂多样性，无法早期发现假疫苗毒的感染，以及目前尚无有效的假疫苗毒感染的剔除方案。尽管，目前临床上假疫苗毒案例占比不高（10%左右），但是对于因假疫苗毒感染的猪场可能是致命的，会导致整个猪场，甚至其关联猪场的清场。行业中针对假疫苗毒株的防控也有一些好消息，就是部分假疫苗毒株感染的案例通过部分清群方法成功净化，尽管群体损失也非常大，但这可能是养猪人能否成功防控住弱毒株的分水岭。

5 非洲猪瘟疫苗研制的展望

ASF是当前危害世界养猪业最重要的猪病。其病原ASFV也几乎是我们面对的最复杂的猪病病原。历经一百年，其疫苗研制的道路仍十分艰巨。

第一，还需要加强对其病原，病原和宿主相互作用的研究，弄清楚其感染、繁殖、致病、免疫等方面的特点；

第二，需要加强对其疫苗的研制，尽管目前尚无商品化疫苗，但是一些疫苗已经展示了较好的免疫保护能力，尽管还存在一些安全隐患，因此，对于理想ASF疫苗的研制和追求还是非常有必要的；

第三，在当前尚无商品化疫苗，非洲猪瘟疫苗商品化时间表还不明确的情况下，我国创造性地开创了ASF野毒的定点清除技术的基础上，未注册非法疫苗造成了临床严重损失，以及西班牙等国家通过OIE认可的无疫苗净化策略的基础上，我国更应坚定地执行ASF疫苗研究科学家说了算，先推进国家的ASF“无疫小区”的建设，再实现区域的ASF净化，最终希望我国生猪产业能彻底地净化ASF，尽管目前来看，还是任重道远；

第四，非洲猪瘟对生猪产业带来了“危”和“机”，伴随生猪行情的急剧下降，目前生猪产业的高速发展也该降降温了。此时正是潜心修炼内功，让管理能力、生产能力、生产质量等追上生猪产业规模发展的步伐，尽快回归到生猪产业本身的高质量稳步发展的道路上。