GnIH/RFRP-3通过受体GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究

王凤霞，魏 萌，司丽娜，杨松鹤，程露阳，乔跃兵，马秀艳

(1.承德医学院,河北 承德 067000 2.承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

乳腺癌是女性最常诊断出的癌症，在女性癌症相关死亡原因中位居第二[1]。在乳腺癌的分子分型中，以雌激素受体阳性(hormone receptor positive，HR+)者居多，约占 70%[2]。目前以手术切除和化疗辅助为主要治疗方式，但手术切除和化疗辅助治疗均会给患者产生严重的生理和心理创伤，寻求不同治疗方式和药物抑制乳腺癌肿瘤细胞的增殖及活力尤为重要[3]。有研究发现，内分泌治疗手段可通过降低或竞争性抑制肿瘤生长依赖的激素(主要为雌激素)或其受体，抑制肿瘤细胞增殖[4]。虽然内分泌治疗副作用较小，但会出现耐药现象，所以寻求新的药物尤为重要。因此，本文旨在研究一种由下丘脑分泌的神经内分泌肽-促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)，通过与受体GPR147结合经下丘脑-垂体-性腺轴抑制促黄体生成素(luteinizing hormone ，LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)的分泌和释放，调节内分泌系统。所以，本研究应用GnIH来探讨其是否对雌激素受体阳性乳腺癌的凋亡造成影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养:人乳腺癌细胞系MCF-7在含有10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2常规培养，待细胞长满培养皿的80%～90%按1∶2～3进行传代，取细胞对数生长期进行相关实验。

1.2药物及其配置:RPRF-3规格1g，购于Tocris Bioscience，U.K。将1g药物溶于0.5mL PBS中配成2mg/mL的母液，每15μL分装于EP管-20℃避光保存。15μL药物溶液溶于培养基用0.22μm的无菌过滤器过滤，获得10000ng/mL的GnIH药物溶液，倍比稀释配置成0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的GnIH药物溶液。RF9规格1mg，购于MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。将1mg抑制剂溶于0.2072mL DMSO中配成10mM的母液，每8μL分装于EP管-20℃避光保存。

1.3试剂:DMEM/RPML1640培养基、胰蛋白酶(美国Gibco)，Biological Industries(BI)公司特级胎牛血清(中美血源)，cell counting kit-8(CCK-8)购于美国APExBIO，青霉素和链霉素、PBS、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于BD公司、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自索莱宝公司，ECL 发光液购自大连美仑公司，兔单克隆抗体(Gapdh、Bcl-2、Bax、caspase-3、cytochrome C、Hsp90、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR)购于Abcam公司，GPR147兔单克隆抗体购于Bioss公司，羊抗兔二抗购于Abclone公司。

1.4仪器:高速冷冻离心机购自北京大龙公司，化学发光图像分析系统购自上海天能公司，酶标仪购自BioTEK公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，荧光定量PCR仪购于BIORAD公司(美国)，双控温干式恒温孵育器购自杭州米欧仪器。

1.5CCK-8检测细胞增值率:收集对数生长期的MCF-7细胞，以8×103个细胞/孔接种于96孔板中，在37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24h，吸弃培养基，实验组分别加入含GnIH浓度为(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL)的培养基，设调零组和PBS对照组，每组设4个复孔，继续培养24后取出，每孔加入100μLCCK-8试剂，于37℃恒温箱中避光孵育2h，酶标仪测定450nm处的吸光度(OD)值，根据公式计算细胞抑制率。细胞增殖抑制率=(PBS对照组OD值-GnIH实验组OD值)/(PBS对照组OD值-调零组OD值)。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡:取细胞对数生长期，胰酶消化重悬继续培养24h加药，PBS对照组、GnIH实验组10000ng/mL培养24h。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化，DMEM完全培养基终止消化，计数1×105，PBS洗两遍(1000r/min，5min)，弃上清液，加入1×Bidding Buffer悬浮，转移至流式管中，分别加入5μLAnnexin V-FITC和5 μL PI，轻轻涡旋细胞，室温25℃暗室孵育15min，每个流式管加入400μL 1×Bidding Buffer，1h内完成上机检测。

1.7实时荧光定量PCR检测相关mRNA表达水平:使用Takare试剂盒提取MCF-7细胞各组总RNA，分光光度计测定RNA浓度及纯度，用反转录试剂盒合成cDNA，每组设3个复孔，经PCR仪进行扩增，按照试剂盒操作方法检测RNA表达水平，采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量，本实验以GAPDH为内参。

1.8蛋白印迹检测相关蛋白表达水平:应用Western Blot法对相关蛋白表达情况进行检测。取MCF-7对数生长期细胞悬液，按GnIH给药浓度(0ng/mL、10000ng/mL)接种于底面积为21cm3的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24h后加药，继续培养24h，取出各组细胞培养皿，吸弃培养基，用4℃预冷的PBS清洗，加适当体积的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱过夜，冰上裂解30min，收集细胞悬液，置于4℃低温高速离心机中以12000r/mim离心15min，取上清。根据BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer与上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10mim，使蛋白变性，冷却至室温-20℃保存。用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白样本(20μg)，分离后电流设定200mA恒流转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，取相应特异性一抗孵育2h(Bcl2 1∶800、Bax 1∶800、Caspase-3 1∶5000、cytochrome C 1∶5000、Hsp90 1∶10000、Gapdh 1∶10000、P531∶1000、PI3K1∶500、AKT1∶10000、p-AKT1∶1000、m-TOR1∶1000和GPR1471∶1000)均为兔单克隆抗体，4℃过夜，复温30min，TBST洗膜缓冲液洗3次，加入HRP荧光标记的二抗(1∶8000)，室温孵育1h，洗膜后加入ECL特超敏试剂，经Tanon 6100凝胶成像仪扫描显影。采用 Image J 软件分析，通过比较目标蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值来确定目标蛋白的相对表达水平。

2 结 果

2.1GnIH对MCF-7细胞增殖的影响:与PBS对照组相比，经GnIH(10000ng/mL)处理MCF-7细胞24h后，CCK-8检测OD值明显降低(P<0.05)，对MCF-7细胞增殖抑制率为9.272%。见表1。

表1 GnIH对MCF-7细胞增殖的影响

2.2GnIH诱导MCF-7细胞凋亡的流式检测结果:经流式细胞仪检测结果如图1，GnIH分别按空白对照组和10000ng/mL药物浓度加入到MCF-7作用24h后，其空白对照组和10000ng/mL组的凋亡率分别为(7.76±1.57)%和(16.14±3.001)%。各组间凋亡率比较差异有统计学意义(F=6.164，P=0.0351)。见图1。

图1 流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡情况

2.3GnIH在mRNA水平上对凋亡相关基因的影响:在MCF-7中对照组和10000ng/mL实验组之间BaxmRNA表达水平上调(F=6.495，P<0.05)、Caspase-3mRNA表达水平上调(F=22.61，P<0.01)和TP53mRNA表达水平显著上调(F=10.31，P<0.05)。同样Bcl-2mRNA和Hsp90mRNA组间比较，Bcl-2mRNA的表达水平在10000ng/mL时显著下降(F=18.26，P<0.01)，Hsp90mRNA的表达水平与Bcl-2一致(F=12.1，P<0.01)。与对照组相比，PI3KmRNA与AKTmRNA的表达水平显著下降(F=3.993，P<0.05；F=3.776，P<0.05)，见表2。

表2 相关基因mRNA的表达水平

2.4凋亡相关蛋白的表达水平:与对照组相比较，GnIH10000ng/mL实验组Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)、P53(P<0.05)蛋白表达水平显著升高，Bcl-2(P<0.01)蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义。见图2。

图2 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达水平

(A 凋亡相关蛋白的印迹图。B 凋亡相关蛋白的相对表达量)

2.5PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达：Western Blot结果显示，经10000ng/mL的GnIH作用MCF-7细胞24h后，与对照组比较PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相对表达量依次降低；在10000ng/mL时与对照组比较PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达

2.6MCF-7细胞系GRP147受体表达情况：对照组与GnIH实验组10000ng/mL相比较，MCF-7细胞系上的GPR147蛋白表达在10000ng/mL是表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

图4 MCF-7细胞系GRP147受体表达情况

2.7拮抗剂RF9干预后GnIH对相关蛋白的影响：抑制剂干预后，实验组GnIH10000ng/mL与对照组相比AKT/p-AKT蛋白表达量显著下降(P<0.05)，GnIH10000ng/mL+抑制剂RF910μmoL实验组与实验组GnIH10000ng/mL比较，MCF-7细胞AKT/p-AKT蛋白表达量显著增高，有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 拮抗剂RF9干预后GnIH/RFRP-3对相关蛋白的影响

3 讨 论

乳腺癌属于激素依赖性肿瘤,雌激素与乳腺癌的发生发展密切相关。在占比较高的HR+ 乳腺癌中，对抗雌激素的内分泌治疗效果是显著的[5]。研究表明，GnIH通过下丘脑-垂体-性腺轴抑制促卵泡激素FSH、黄体生成素LH释放，抑制卵泡颗粒层细胞增生分化，抑制卵巢发育，降低雌激素合成与分泌。有研究发现[6]，促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)对细胞凋亡有影响，但作用机制尚不明确。

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)是一类七次跨膜的蛋白家族，与神经递质,激素等配体结合激活GPCR，使各种细胞外信号转入细胞内,从而在调节细胞功能中起重要作用,这也和人类多种肿瘤的发生、发展和转移有着密切联系。本研究使用的GnIH其受体为G蛋白偶联受体147(G protein-coupled receptor147，GPR147)是GPCR家族成员，当GnIH与其膜受体GPR147结合后，将GnIH从细胞外输送到胞体内，引起细胞生长状态的改变。本实验结果显示，人乳腺癌细胞系MCF-7膜上存在GPR147受体，并且随着GnIH药物浓度的升高，促进了GPR147受体的表达，造成MCF-7细胞的凋亡率增加。此外，激活的GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。PI3K/AKT/mTOR信号通路参与了细胞的生长、增殖、凋亡等多种生物学过程，并且与多种肿瘤的发生发展密切相关[7]。PI3K通过激活丝氨酸/苏氨酸酶AKT，AKT又通过大量的调节子最终造成丝氨酸/苏氨酸酶MTOR的磷酸化。在肿瘤细胞中PI3K/Akt/mTOR信号传导途径常处于被激活状态,从而维持其活跃的增殖能力。但是，本研究结果显示GnIH在10000ng/mL时与对照组相比抑制了MCF-7细胞的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表达水平，表明当GnIH达到10000ng/mL时较明显抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而抑制MCF-7的增殖。GPR147特异性拮抗剂RF9，可以抑制其受体活性，引起一系列级联反应[8,9]。本实验GnIH联合RF9作用MCF-7细胞系，结果显示抑制剂干预后，实验组GnIH1000ng/mL与对照组相比AKT/p-AKT蛋白表达量显著下降(P<0.05)，GnIH1000ng/mL+抑制剂RF910μmoL实验组与实验组GnIH1000ng/mL比较，MCF-7细胞AKT/p-AKT蛋白表达量显著增高，有统计学意义(P<0.05)。结果提示，GnIH可能通过影响GPR147的活性发挥抑制MCF-7细胞增殖的效应。

细胞凋亡是细胞受特定基因调控的主动性的有序死亡，主要由内源性线粒体途径发挥作用[10]。线粒体作为细胞凋亡的控制中心，当细胞受到外界药物刺激时会损伤线粒体功能，引起Bcl-2家族中Bcl-2/Bax这两种蛋白相对表达量的变化[11]。p53是与癌症相关的最常见突变基因,在多种应激诱发的凋亡中起关键作用，当细胞接受到凋亡信号后p53蛋白行使转录因子的作用上调Bax/Bcl-2比值，线粒体膜电位变化并最终提高线粒体外膜通透性，同时会将细胞色素C(cytochrome C，Cyto C)释放至细胞质，进一步激活caspase-3增强细胞凋亡。在本实验中可以看出，与对照组比较，GnIH1000ng/mL实验组P53、Bcl-2、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表达水平无显著变化，GnIH10000ng/mL实验组P53、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表达水平显著上调，Bcl-2蛋白表达量显著下调。说明低剂量的GnIH对MCF-7细胞凋亡作用较小，而药物剂量达到10000ng/mL时细胞凋亡率较显著。

热休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)在肿瘤的发生发展进程中起重要作用的分子伴侣蛋白家族[12]。其中[13]，HSP90是热休克蛋白家族中最活跃的分子伴侣之一，PI3K和AKT都是HSP90重要伴侣蛋白。HSP90在多数肿瘤中高表达，参与肿瘤的增殖、迁移和侵袭。结合Western Blot和qRT-PCR实验结果，促性腺激素抑制激素对雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7细胞HSP90蛋白的表达情况，发现GnIH可以抑制HSP90的表达，提示GnIH通过抑制HSP90的表达进而促进MCF-7的凋亡，推测GnIH作用肿瘤细胞可能与应激反应有关。

总之，GnIH可以抑制雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7细胞的增殖。其作用机制可能通过GPR147受体抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路和激活线粒体凋亡途径引起凋亡因子Bax和caspase凋亡家族上调有关。另外，由于GnIH抑制热休克蛋白HSP90的表达可推测，通过抑制肿瘤细胞的应激反应进而促进凋亡。然而，本研究仅为体外实验未涉及到体内实验，并且对具体机制及其信号通路尚有欠缺，亟待后续进一步深入研究。