基于TGF-β/Smad通路研究益心附葶饮抗腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化的机制

刘 婧，张 妍，李凡勃，贺江超，杨 敏

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是多种因素造成心肌损伤后过度代偿修复，导致心功能的恶化，甚至诱发心力衰竭。高血压是引发心肌纤维化的主要诱因，心肌纤维化是高血压心室重构的基本病理改变。高血压导致心肌纤维化与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)有关[1-2]。而转化生长因子β(TGF-β)作为重要细胞因子参与了高血压心肌纤维化形成过程。TGF-β可促进胶原基因表达和诱导心肌成纤维细胞增殖，进而导致细胞外基质(ECM)合成增加。也有研究表明TGF-β/Smad通路是心肌纤维化过程中重要的信号通络[3-5]。益心附葶饮是雷瑗琳主任在长期临床实践中总结出的治疗慢性心力衰竭的有效方剂，前期临床研究表明该方具有增强心力衰竭病人心肌收缩力、改善心功能的作用，前期动物实验也证明该药对心力衰竭有抑制作用[6]。本研究拟通过观察益心附葶饮对腹主动脉缩窄大鼠心肌组织中胶原纤维比例及TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA基因表达量的影响，来分析该方对TGF-β/Smad通路的抑制作用。希望更进一步明确该方防治高血压心肌纤维化、治疗心力衰竭的靶点，为该方的进一步推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级雌性SD大鼠35只，体质量(230±20)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2020-035。

1.1.2 实验试剂 RNA Trizol Reagent，批号：vs18061730，规格：每瓶50 mL，合肥博美生物科技有限公司生产；异丙醇，货号：B422BA0020，规格：每瓶50 mL，上海生工生物工程技术服务有限公司生产；氯仿，PrimeScript RT reagent Kit，货号：RR047A，规格：100 Preps，宝日医生物技术有限公司生产；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，货号：RR820A，规格200Rxns，宝日医生物技术有限公司生产；无水乙醇(AR级)，批号：GB678-90，规格：每瓶500 mL，成都海兴化工试剂有限公司生产。

中药：益心附葶饮原方(黑附片20 g先煎，炒葶苈子30 g，生白术15 g，桂枝12 g，川芎12 g，茯苓皮30 g，太子参30 g，丹参30 g，麦冬12 g，生地黄15 g，醋五味子6 g，炙甘草10 g)，由西安市中医院制剂科提供颗粒剂。根据体表面积计算法，大鼠用量为3.5 g/(kg·d)，使用时冲调至需要浓度。

1.1.3 仪器设备 转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；BMJ-A型包埋机(常州郊区中威电子)；RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备有限公司)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪有限公司)；数字切片扫描仪Pannoramic 250(济南丹吉尔电子有限公司)；图像软件Image-Pro Plus 6.0(美国Cybernetics公司)；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪(美国ThermoFisher仪器有限公司，型号PIKORed 96)；低温离心机(湖南湘仪实验仪器厂，型号C2500)；热循环仪(美国ThermoFisher仪器有限公司，型号TCA0096)；优普超纯水制造系统(成都超纯科技有限公司，型号UPH-Ⅱ-10T)；旋涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司，型号XH-B)；电子天平(美国康州HZ电子科技有限公司生产)；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂，型号SYQ-DSX-280B)；移液枪[大龙兴创实验仪器(北京)有限公司，规格：1 000 μL、200 μL、20 μL、10 μL、2 μL]；枪头(美国Axygen公司，规格：1 000 μL、200 μL、20 μL)；EP管(美国Axygen公司，规格：1.5 mL、0.2 mL、100.0 μL)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 大鼠常规喂养1周，采用腹主动脉缩窄法制作心力衰竭大鼠模型。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，开腹后分离出腹主动脉，以钝性7号针头4号线结扎，结扎后观察到肾脏缺血变白，迅速抽出针头，缝合关腹。连续3 d腹腔注射青霉素4×104U/d。假手术组开腹分离出腹主动脉后，穿线不结扎。

1.2.2 分组 造模过程死亡3只大鼠，将造模成功的20只大鼠采用随机数字表法分为模型组与中药组，每组10只。在剩余12只大鼠中随机取10只作为假手术组。

1.2.3 给药方法 中药组每只大鼠灌胃3.5 g/(kg·d)，连续灌胃8周。模型组与假手术组以等体积蒸馏水灌胃，连续灌胃8周。其余不做特殊处理，每组常规喂水、喂食。

1.3 检测方法

1.3.1 Masson染色与心肌纤维化检测 处死大鼠后，打开胸腔，取出心脏，洗净血液，分离左室，于左室最大横径处横切开，将左心室分为两个部分。一部分组织甲醛固定、石蜡包埋、Masson染色后切片，每张切片放大100倍先观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域，400倍采集图像，每个部位选3个视野，用图像分析软件(Image Pro Plus 6.0，美国)测量胶原纤维面积与所选视野面积的比值作为心脏胶原容积分数(collagen volumetric fraction，CVF)；另一部分组织置于-80 ℃低温冰箱冻存，待进行RT-PCR检测。

1.3.2 RT-PCR

1.3.2.1 样本总RNA提取 将组织用剪刀剪碎，取100 mg组织加入1 mL TRIZOL。将匀浆样品在室温15～30 ℃环境放置5～15 min，使核酸蛋白复合物分离。加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡，室温放置，2～8 ℃、12 000 r/min离心15 min。样品分为3层：底层为红色有机相，上层为无色水相。把水相转移到新无酶EP管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，室温放置。2～8 ℃、12 000 r/min离心15 min，弃其上清。用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，室温放置，2～8 ℃、5 000 r/min离心3 min，弃上清。用枪头吸出残余乙醇，加入10 μL DEPC水，4 ℃放置备用。

1.3.2.2 基因组DNA的去除反应(见表1)

表1 基因组DNA去除反应体系

1.3.2.3 逆转录反应(见表2)

表2 逆转录反应体系

1.3.2.4 引物设计 本实验引物设计从美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中搜索基因序列，使用Primer Premier引物设计软件筛选设计引物。设计完成后交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。具体引物基因序列见表3。

表3 引物及碱基序列

1.3.2.5 逆转录PCR反应(见表4、表5)

表4 RT-PCR反应体系

表5 RT-PCR反应条件

2 结 果

2.1 3组大鼠心脏组织内纤维组织表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠心脏纤维组织表达面积百分比明显升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组心脏纤维组织表达面积百分比明显降低(P<0.05)。详见表6、图1。

表6 3组大鼠心脏组织内纤维组织表达面积百分比比较(±s)

2.2 3组大鼠心脏组织TGF-β1mRNA的表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠心脏组织中TGF-β1mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠心脏组织中TGF-β1mRNA表达降低(P<0.05)。详见表7。

表7 3组大鼠心脏组织TGF-β1 mRNA的表达水平比较(±s)

2.3 3组大鼠心脏组织Smad3 mRNA的表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠心脏组织中Smad3 mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠心脏组织中Smad3 mRNA表达降低(P<0.05)。详见表8。

表8 3组大鼠心脏组织Smad3 mRNA的表达水平比较(±s)

2.4 3组大鼠心脏组织Smad7 mRNA的表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠心脏组织中Smad7 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠心肌组织中Smad7 mRNA表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表9。

表9 3组大鼠心脏组织Smad7 mRNA的表达水平比较(±s)

3 讨 论

本实验中腹主动脉缩窄法主要造成心脏后负荷增加，主动脉缩窄早期表现出左室肥大和室壁增厚，随后出现左室扩张，收缩和舒张功能障碍逐步加重[7]。压力性负荷过重时心室负荷会转化为单个心肌细胞膜压力，这是心肌能量消耗的主要决定因素。心脏可以通过增加膜厚度来适应升高的压力负荷。根据拉普拉斯定律，增加细胞膜厚度可以减少膜压力，提高其能量效率[8-9]，但在代偿超过一定范围后，受损组织内部和周围纤维结缔组织增加，最终导致纤维化，也是心肌损伤后心脏重塑的标志[10]。本实验中，模型组较假手术组胶原纤维比例明显增加，中药组胶原纤维比例较模型组降低。表明益心附葶饮减轻了腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化程度。

TGF-β/Smad信号通路广泛参与了心肌肥大、心肌纤维化、心力衰竭多个病理过程[11]。活化的TGF-β首先与细胞膜表面Ⅱ型TGF-β受体(TβR)结合，形成异源二聚体复合物。TβRⅠ识别并结合该二聚体复合物，TβRⅡ将TβRⅠ胞质区中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，进而使TβRⅠ激活。活化的TβRⅠ进一步磷酸化R-Smad蛋白，后者再与Co-Smad结合成为转录复合物，调节特定靶基因。而TGF-β1通过活化一系列通路信号分子和激酶，诱导心肌成纤维细胞增殖，细胞外基质沉积，从而介导血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱发心脏重构[12]。另有研究表明，除AngⅡ外，醛固酮、内皮素等均可刺激TGF-β/Smad信号通路参与高血压心肌纤维化[13-14]。Smad蛋白通过细胞膜上特异性受体将TGF-β信号传递至核内。Smad3、Smad7蛋白已被鉴定为TGF-β1通路下游介质。Smad3属于受体调节型蛋白，Smad7属于受体抑制型蛋白。有研究表明Smad3在心肌梗死区表达明显上调，Smad3作为TGF-β1下游介质被激活，从而促进心肌纤维化[15-16]。Smad7作为TGF-β/Smads信号通路中的关键负调节因子，通过以下几方面来调节TGF-β/Smad信号通路：①Smad7通过其MH2结构域与TβRⅠ结合并阻断R-Smad激活来抑制TGF-β信号传导；②Smad7与Smad4竞争与R-Smad聚集，通过招募蛋白磷酸酶E3泛素连接酶或去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)来调节TβRⅠ的活性或稳定性；③Smad7可以同Smad4竞争与R-Smad结合，并招募E3泛素连接酶神经前体细胞表达发育调控样蛋白4(NEDD4L)激活R-Smad，导致其多泛素化和蛋白酶体降解[17-19]。这与本实验结果基本吻合。从本实验结果分析：模型组TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平明显升高，Smad7降低，证明腹主动脉缩窄导致心力衰竭过程中，TGF-β/Smad通路发挥了重要作用，TGF-β1、Smad3起到了促进心肌纤维化作用，而Smad7起到了抑制作用。中药组TGF-β1、Smad3的mRNA表达量较模型组明显降低，证明在心肌纤维化过程中益心附葶饮有效抑制了心肌组织中TGF-β1及Smad3 mRNA的过度表达。中药组与模型组Smad7 mRNA的表达比较差异无统计学意义，可能与样本量较少有关，也可能与实验测定周期有关。

中医学认为，心力衰竭归属“心衰病”范畴，心衰病病位在心，与肾、脾、肺等脏腑均有密切联系。《素问·痿论》记载“心主一身之血脉”，全身血液能够在体内顺畅地运行全依赖心阳推动。心阳推动无力，则血行迟缓，甚则瘀阻脉道。因此，气阳两虚是中医心衰病发作重要的一种病理基础，也是影响病情转归的决定因素。病程一旦迁延不愈，累及元阳，导致心肾阳虚。在病情发展过程中，不可避免地形成许多病理产物，常见的病理产物有水饮、痰浊等。一方面阳气亏虚，温煦失司，气化无力而水饮内停；另一方面，气虚日久，瘀血停滞，血不利则化为水。水为阴邪，水饮痰邪久留则更伤阳气。如此形成恶性循环。本病治疗当以益气温阳利水为主[20]，在此治则指导下，雷瑗琳主任自创益心附葶饮，该方以益气温阳为主要治则。方中黑附片、炒葶苈子为君药，附子温肾通阳，葶苈子平喘利水，共同起到温阳利水之效果。白术、太子参益气健脾，桂枝助君药温振心肾阳气，佐以川芎、丹参行气活血，生地、五味子滋阴，甘草调和诸药。全方组方精当而全面，有补有利，以温通心肾阳气为主，补而不滞。在利水同时又兼顾滋阴，防止利水太过耗伤阴液。

本研究分析了腹主动脉缩窄大鼠心肌纤维化比例以及益心附葶饮干预后的变化，证明了益心附葶饮对纤维化有抑制作用；又用RT-PCR法分别测定了假手术组、模型组、中药组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3、Smad7的mRNA表达，证明了TGF-β/Smad通路与心肌纤维化密切相关，该方抗心肌纤维化可能与抑制TGF-β/Smad信号通路有关。下一步将继续通过对TGF-β/Smad通路下游靶基因进行调控及基因敲除，进一步研究该方对TGF-β/Smad通路的抑制作用；另外，还将继续研究不同剂量药物对心力衰竭不同阶段的作用，进一步细化研究该方抗心肌纤维化、纠正心力衰竭的机制，为该药进一步研制成药提供理论基础。

综上所述，心肌纤维化是心力衰竭重要病理改变，益心附葶饮具有抑制心肌纤维化的作用，TGF-β/Smad信号通路可能是该方治疗心力衰竭的主要靶点。