孢子丝菌病及其病原真菌的再认识

2021-12-01黄怀球

中山大学学报(医学科学版) 2021年5期

黄怀球

（中山大学附属第三医院皮肤科，广东广州510630）

孢子丝菌病（Sporotrichosis）是由孢子丝菌复合体引起的皮肤、皮下组织及局部淋巴管的慢性感染，是全球分布最广的深部真菌病。孢子丝菌复合体（Sporothrixcomplex）属于子囊菌门，长喙壳菌目，长喙壳菌科，孢子丝菌属，由Schenck于1898年首次发现并分离命名为申克孢子丝菌，在我国1916年刁信德首次报道［1］。孢子丝菌常见于土壤和腐木中，通过皮肤创口接种感染人类或动物，因此，从事花卉、农业和木材开采的人员易患孢子丝菌病。人类也可通过和动物密切接触感染孢子丝菌。孢子丝菌病临床表现多样，严重程度不一，分为皮肤型和皮肤外型。皮肤型可分为局限在皮肤或皮下组织的固定型和沿淋巴管分布的淋巴管型，以及通过自身接种或血行播散引起的皮肤播散型，临床上大多数孢子丝菌病表现为淋巴管型［2］，少数出现皮肤外型，如肺孢子丝菌病由于吸入孢子丝菌复合体的分生孢子导致肺部感染。近年来随着免疫受损人群数量增多，孢子丝菌病在全球的发病率逐年升高［3］，在南美地区已成为严重危害人类健康的人畜共患病［4］，人们对孢子丝菌复合体的认识也日益深入。本文就孢子丝菌复合体的病原学、流行病学、致病性和分子生物学研究进展进行综述。

1 病原学

1.1 孢子丝菌复合体的分类及对比

多年以来，申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）被认为是导致孢子丝菌病的唯一病原体。既往孢子丝菌病病原菌的鉴定是基于形态学以及核糖体DNA（rDNA）分析，de Lima Barros［5］和李珊山等［6］发现用传统方法鉴定为同一种的菌株却对同种治疗药物有着不同的反应，提示该病的致病菌可能并非单一的物种。2007年Marimon等［7］根据真菌形态、糖同化实验等将孢子丝菌分出4个新种：巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）、球形孢子丝菌（Sporo⁃thrix globosa）、墨西哥孢子丝菌（Sporothrix mexi⁃cana）以及卢艾里孢子丝菌（Sporothrix luriei），这几种孢子丝菌与人类致病相关，因此称为“临床致病群”［8］。通过对孢子丝菌几丁质合成酶、β-微管蛋白和钙调蛋白基因等分析，将孢子丝菌复合体分为5组菌株：第一组（Clade I）分离菌株来源于巴西，为巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）；第二组（CladeⅡ）菌株为申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii），其中又被分成2个亚组：Ⅱa组来自美国和南美洲的菌株，而Ⅱb组来自南美洲；第三组（CladeⅢ）分离菌株来自中国、印度、意大利、日本、西班牙、美国和英国，为球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）；第四组（CladeⅣ）为来自墨西哥的墨西哥孢子丝菌（Sporothrix mexicana）；第五组（Clade V）为来自欧洲的白孢子丝菌（Sporothrix pallida，原称Sporothrix albicans）。不同组菌株的分生孢子有差异：第一组和第三组分生孢子呈球形；第二组分生孢子呈三角形；第四组分生孢子呈梭形；第五组则不存在分生孢子［9-10］。

孢子丝菌复合体在遗传学、流行病学、耐药性和引起的临床表现等方面均存在很大差异。申克孢子丝菌在遗传学方面具有高度的遗传变异性，巴西孢子丝菌和球形孢子丝菌各自基因却具有较高的同质性［11-12］。不同亚类的孢子丝菌的分布地区存在差异：球形孢子丝菌广泛分布于亚洲、欧洲以及美洲，亚洲是主要流行地区［13-14］；申克孢子丝菌在全球广泛分布，主要集中在热带及亚热带地区，如阿根廷、墨西哥、秘鲁、南非等；巴西孢子丝菌主要局限在巴西东南部地区［15-16］；墨西哥孢子丝菌曾被认为只局限在墨西哥地区，巴西［15］和葡萄牙［17］也发现有墨西哥孢子丝菌病例；卢艾里孢子丝菌稀少且致病力低，目前只有非洲、意大利、印度有报道［18］。本课题组和国外学者开始共同关注和研究临床药物治疗失败菌株和无致病性环境分离株的特征［19-20］。球形孢子丝菌对唑类药物耐药性在逐渐增强，巴西孢子丝菌在体外实验中对大多数抗真菌药都高度敏感［21］。球形孢子丝菌主要引起固定型孢子丝菌病；申克孢子丝菌和巴西孢子丝菌常引起典型的淋巴管型孢子丝菌病。

1.2 形态学

孢子丝菌复合体在环境中（25℃）呈菌丝相，在人体内（37℃）呈酵母相。孢子丝菌复合体在实验室采用沙保氏葡萄糖培养基（SDA培养基）、酵母浸出液葡萄糖培养基（YPD培养基）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基）中于28℃培养时，复合体不同菌株菌落形态相似，呈现灰褐色、绒毛样菌落生长。显微镜下容易观察到直径为1~3µm的薄、透明和有隔膜的菌丝，菌丝常产生分枝［10］。在脑心浸出液肉汤培养基（BHI培养基）37℃培养，可见柔软、光滑、湿润的酵母样菌落生长。孢子丝菌复合体的申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）最重要，是孢子丝菌属第一个被描述的菌种，申克孢子丝菌引起的病例在全世界均有报道。申克孢子丝菌在25℃SDA和37℃BHI液体培养基培养时呈现不同的形态学特征，SDA液基中25℃培养96 h后镜检可见细长的分枝、分隔菌丝，分生孢子梗由菌丝侧呈锐角或直角生长。转入BHI液基中37℃培养24 h后菌丝变粗变短，部分断裂；培养36 h后可见短棒样结构形成，48 h后则可见雪茄样、卵圆形或圆形的分生孢子。

1.3 自然生长环境

孢子丝菌复合体通常生长在温暖潮湿如热带和亚热带地区的环境中，适宜生长的平均温度为20℃~25℃，相对湿度高于90%。有些菌株可能存在耐热性，另外有些菌株能在pH为3.5~9.6的范围内生长［3，22-24］。尽管全年都有孢子丝菌病的发生，本病一般在秋季和冬季高发，这与当地雨季结束有关，例如墨西哥在雨季结束时，环境的温度和湿度都达到了孢子丝菌的最适生长条件；同时在这两个季节，当地人会进行收割粮食、蔬菜等与植物长时间接触的劳作，增大了与孢子丝菌接触的风险。在大多该病流行的国家，孢子丝菌复合体多生长在纤维素、草、有机物、木材等含量高的土壤和环境中［3，22，25］。另外有中国学者报道从玉米的根、茎中分离出球形孢子丝菌［26］。

1.4 感染途径

孢子丝菌入侵主要有两种途径：宿主创伤后感染和吸入性感染［27］。自然环境中的孢子丝菌为腐生菌，以菌丝相产生大量的分生孢子，上皮和黏膜外伤破损失去连续性被侵入，认为这是皮肤感染的常见原因。自孢子丝菌能从动物的蹄以及牙齿中被分离出来，认为本病也可通过动物媒介进行传播。如啮齿类动物中大鼠和松鼠是常见的动物媒介；由昆虫（如蚂蚁和蜜蜂）、爬行动物、蜘蛛以及蝙蝠的叮咬造成疾病的传播也有报道［3，22］。近年来，养猫、狗等作为宠物的数量越来越多，动物源性的孢子丝菌病也逐渐增多，且从动物的爪、皮损以及它们的窝中分离出孢子丝菌。特别需要指出的是，与经典的通过污染土壤或植物的传播方式不同，猫在巴西孢子丝菌的传播中起到重要作用，体现了与巴西孢子丝菌在进化以及传播中的相互联系。近10年来巴西孢子丝菌为了适应宿主做出了适应性改变，如提高了耐热性。猫的体温在38℃~39℃之间，巴西孢子丝菌更能适应在较高温的环境中生长。在37℃培养时，巴西孢子丝菌生长最好，其次是申克孢子丝菌。而其他种类的孢子丝菌，如球形孢子丝菌和墨西哥孢子丝菌对温度更为敏感，最高可耐受的温度为35℃。巴西不同地区的31只猫以及2条狗上分离出了33株孢子丝菌，其中32株鉴定为巴西孢子丝菌，1株鉴定为申克孢子丝菌，表明造成巴西地区猫感染的大多数为巴西孢子丝菌［15，28］。迄今为止，动物孢子丝菌病的最大疫情暴发在里约热内卢，疫情已经蔓延至巴西南部地区，预估超过10 000只猫和200只狗被感染，经检测此次疫情主要是由巴西孢子丝菌引起［15］。人类可以通过被猫抓伤或咬伤感染，猫传播毒性更强的酵母相巴西孢子丝菌，而不是其菌丝相或分生孢子。

少数情况下，孢子丝菌可通过呼吸道吸入引起原发性的肺部感染［3，22］。目前对吸入性感染的研究尚少，主要是在免疫状态低下的病人特别是感染人类免疫缺陷病毒或是患有获得性免疫缺陷综合征的病人中有报道［29-30］。

2 流行病学

2.1 地域分布

孢子丝菌病主要集中于热带、亚热带，在美国，南美洲（巴西、哥伦比亚、危地马拉、墨西哥、秘鲁），亚洲（中国、印度、日本）和澳大利亚均有报道［3］。

在我国，几乎所有省份都有孢子丝菌病病例的报道［18］，吉林省报道的病例数最多。在该地区的玉米秆、枯枝、腐烂木材、污泥和土壤等样本中可检出有申克孢子丝菌，其中据田亚萍等［31］的调查，在吉林地区自然环境中收集腐木、土壤等标本70份，分离出申克孢子丝菌的阳性率为8.6%。在吉林附近的内蒙古呼和浩特市，姜长友等［32］从69份标本中分离出8株申克孢子丝菌，阳性率为11.6%。另外在中国东南部，纪青等［33］对广东省珠海市金湾区的一项孢子丝菌生态学的研究表明，该研究从珠海金湾区自然环境中分离出了申克孢子丝菌24株，分离率为15%，可见孢子丝菌在我国广泛存在。后来对中国收集的菌种按照新的分类方法重新鉴定，基本上结果都是球形孢子丝菌［34］。

中国北方的大多数报道［23］指出，在寒冷季节北方地区的温度通常低于零摄氏度，此时发病率更高，与孢子丝菌适宜在温暖湿润的环境中生长的观点截然不同，冬季发病率增高可能的原因是当地农民会用到玉米秸秆、芦苇和树枝去燃烧以及取暖。这些燃烧物上的真菌会导致室内污染，因此，这可能是导致孢子丝菌病在寒冷季节高发的重要因素［2］。除吉林省外，孢子丝菌病在其他省份也很普遍。总体来看，在中国其他地区，大部分孢子丝菌病病例都聚集在长江沿岸的省份（四川和江苏）和中国东南部的省份（广东和广西）。

在国外某些高流行地区，例如秘鲁的发病率为每10万人48至98例，儿童的平均发病率为每10万人156例［35］；在墨西哥的哈利斯科山脉和普埃布拉山脉地区，据统计每1 000名居民中有25例患病［18］。日本从1946年到1982年每年报告约155例［36］，现在已降至每年50例。相比之下，巴西的病例数逐年增加，里约热内卢的Evandro Chagas临床研究所在1998年至2004年间报告了759例人类、1 503例猫和64例狗孢子丝菌病病例，这些结果与1987年至1997年只发现13例人类病例形成鲜明对比［37］。Barros等［38］描述了1998年至2009年间在巴西里约热内卢确诊的大约2 200例人和3 244例猫孢子丝菌病病例，表明这20年出现疾病在猫科动物和人群中爆发，这是世界上有记录以来人类和动物孢子丝菌病最大爆发的报道。巴西孢子丝菌可从动物传播给人类，对其监测应包括环境、人与动物，非常迫切需要从“One health”角度提出孢子丝菌病预防的综合方法模型，由多个部门同时有效实施和执行孢子丝菌病蔓延的防控政策［39］。

2.2 患病的职业、性别和年龄特征

孢子丝菌病患者与职业关系密切，园林工人、狩猎者、农民、矿工和木材开采者患病比例较大［2］，感染的概率取决于职业的暴露风险，不同人的职业以及生活习惯影响着他们的暴露风险。例如，犰狳猎人在乌拉圭患病率更高，由于他们在捕猎的过程中容易受伤导致感染［40］。女性的患病率在印度东北部和日本较高，由于她们更多地参与农业活动［36，41］。在南非，男性患者与女性患者的数量之比约为3：1，由于男性更频繁地参与了户外工作以及采矿活动［42］。在秘鲁安第斯山脉，儿童的发病率是成人的3倍。病例对照研究［35］表明，在庄稼地和脏地板上玩耍可能是这些儿童的感染途径。

3 致病因素分析

孢子丝菌复合体室温下（25℃）呈无致病性的菌丝相生长，在人体内（37℃）则呈现具有致病性的酵母相生长，这种由温度诱导下的菌丝相向酵母相的转化被认为是其毒力基因的表达以及致病能力形成的过程［43］。孢子丝菌复合体中的各种菌株的毒力因素存在显著差异，Arrillaga-Moncrieff等［44］报道，在孢子丝菌复合体中，巴西孢子丝菌是毒力最强的，其次是申克孢子丝菌、卢艾里孢子丝菌和球形孢子丝菌。

孢子丝菌病临床表现的差异与机体的免疫状态有关，与孢子丝菌复合体中各种菌株毒力的差异密切相关。球形孢子丝菌感染绝大多数仅引起皮肤型孢子丝菌病，以固定型和淋巴管型为常见，固定型的临床表现呈多样性，皮肤播散型少见，黏膜和皮外形偶见［45］。巴西孢子丝菌与其他种类不同具有特别强的毒力，可引起严重的炎症反应的皮肤症状，引起眼睑皮肤感染以及其他的眼部后遗症，此外还引起超敏反应，最常见表现包括结节性红斑和多形性红斑、关节痛、肌痛和关节炎，这些都与动物传播相关［46］。

目前孢子丝菌的毒力研究主要针对细胞壁，因为细胞壁是真菌应对宿主免疫反应的主要结构。酵母相的细胞壁含有黑素，黑素在细胞表面形成致密的保护膜，具有抵抗巨噬细胞吞噬、抗氧化、增强细胞黏附性以及增加真菌耐药性等作用［47］。实验证明［48］，产生黑素的分生孢子比不能产生黑素的分生孢子更能抵抗宿主细胞的吞噬和杀伤，甚至能抵抗氧、氮氧自由基。另外粘附力是真菌侵入宿主的先决条件，Kadry等［49］研究表明：细胞壁中的甘露糖和肽聚糖均参与了粘附的过程，并且它们在与宿主细胞外基质蛋白的粘附作用起到了关键的作用。Alba-Fierro、Portuondo和Rodrigues等［50-52］研究表明，申克孢子丝菌具有可识别宿主层粘连蛋白、纤维连接蛋白等的整合素或粘附素样凝集素样分子。Toll样受体（TLR）家族作为重要的模式识别受体，能识别入侵的病原体介导各种免疫应答，课题组验证了皮肤角质形成细胞和巨噬细胞的TLR2和TLR4对孢子丝菌的识别作用［53］。

几丁质也是真菌细胞壁的重要组成成分之一，可与葡萄糖、甘露糖、蛋白多糖等交联，构成保护屏障，是真菌重要的毒力成分［3］。本课题组发现从申克孢子丝菌菌丝相细胞壁提取的富含几丁质的多糖能增强感染小鼠清除真菌能力，在体外促进小鼠巨噬细胞吞噬真菌孢子，调节促炎细胞因子TNF-α和IL-12分泌［54］。本课题组用姜黄素处理申克孢子丝菌，发现姜黄素可以通过增加细胞壁几丁质的暴露增强宿主巨噬细胞杀伤作用而清除真菌［55］。姜黄素极大地上调了几丁质合成有关的PKC信号通路，几丁质合成增多，重新分配到细胞壁的外层，这被认为是真菌应对恶劣环境的主要适应机制。本课题组研究发现用姜黄素处理的分生孢子，几丁质暴露在细胞壁外层，容易被巨噬细胞识别，从而调节宿主对真菌的免疫反应。同时姜黄素可刺激巨噬细胞在早期分泌TNF-α，促进了真菌的清除。我们还首先报道了姜黄素与特比萘芬联合作用于申克孢子丝菌有协同作用［56］。机体可以分泌针对真菌的几丁质或类几丁质酶抵抗病原体，课题组发现申克孢子丝菌不能诱导巨噬细胞CHI3L1表达升高，这可能导致了孢子丝菌病皮损慢性化难以愈合［57］。

4 基因组学与转录组学研究

由于全世界每年都有大量的感染病例报道，对临床相关的孢子丝菌的研究越来越引起人们的关注。本课题组联合国际同行对临床药物治疗失败的临床株的基因组进行了比较基因组学研究，发现临床药物治疗失败菌株和低毒力无效病性临床分离株的基因组可能具有一定特征［19-20］；进一步分析了申克孢子丝菌菌丝相和酵母相转录组表达谱及建立了孢子丝菌基因组数据库［58］，发现调控孢子丝菌菌丝相和酵母相的形成与维持的分子途径异常复杂，可能由不同的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的表达差异以及一些尚未明确功能的蛋白质编码基因决定所造成。L-精氨酸在真菌中参与多种细胞活动，特别是细胞形态的发生以及真菌繁殖的调控［59］，如在盾壳霉（Coniothyri⁃um minitans）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中，L-精氨酸参与调控它们无性生殖的过程，对它们分生孢子的形成至关重要。盾壳霉中由于氨基甲酰磷酸合成酶（CSP1）编码基因（L-精氨酸合成的关键基因）的破坏而产生的突变会导致盾壳霉只能长出菌丝而不能产生孢子；在稻瘟病菌中，与盾壳霉CSP1基因的直向同源基因为CPA2基因，CPA2基因的破坏同样影响稻瘟病菌分生孢子的形成［59-60］。在申克孢子丝菌菌丝相中氨基甲酰磷酸酶合成基因（ORF Spsc_00280）与酵母相相比表达下调，表明L-精氨酸的生物合成参与了申克孢子丝菌的形态的转化［58］。

近年来，组氨酸激酶（Histidine protein kinases，HPK），（在孢子丝菌中由DRK1基因编码）被认为是包括孢子丝菌在内的几种双相真菌中菌丝相向酵母相转化以及毒力变化的主要调节因子［61-62］。HPKs可以使组氨酸残基磷酸化，是一大类信号传导酶，HPKs与其下游的靶蛋白共同组成二组分信号系统。MAPKs级联系统和cAMP信号通路被认为参与真菌的形态转化及致病力的形成，而两者又都被上游的HPKs二组分调控系统所调控，故Nem⁃ecek等［63］认为DRK1可能是调控双相真菌形态转化的启动因素。据报道［61-62］，申克孢子丝菌中该基因在酵母相中的表达与菌丝相比上调，但是在本课题组的研究中发现申克孢子丝菌的DRK1基因在菌丝相和酵母相中的表达并无差异，原因可能是诱导菌丝相以及酵母相时的实验条件不同所致，同时指出在诱导成酵母相后，DRK1基因表达水平可能下降，由于其他因素维持酵母相［58］。有趣的是，该研究同时还发现了另一种由ORF Spsc_09813编码的HPK，这种新发现的HPK在申克孢子丝菌中两种形态间的表达存在差异，在酵母相中表达上调。真菌中双相转换的分子机制非常复杂，取决于许多基因的表达，这些象可能由不同的化学、物理刺激引起，这些刺激通过调控特定分子通路激活特定下游分子来实现。

Prakash等［64］分析了致病性孢子丝菌属的基因组特征，揭示了其基因组多个扩增的基因家族。引起粘连的毒力相关基因（CFEM域和LysM结构域），铁捕获基因（高亲和力铁离子渗透酶（high-affinity iron permease，FTR1）和多铜氧化酶，组织降解蛋白酶（丝氨酸和天冬氨酸蛋白酶）和转运蛋白基因（MFS和OPT转运蛋白）在孢子丝菌属中得到扩增。和其他双相真菌相比，孢子丝菌含有更多的胞外结构域，如CFEM（common in fungal extracellular mem⁃brane）蛋白结结构域和LysM结构域。CFEM结构域是真菌独有的一种蛋白结构域，含有8个半胱氨酸，在宿主与病原体的相互作用中发挥重要作用［65］。含有CFEM结构域的蛋白质参与信号转导受体和粘附分子的形成，参与铁获取和细胞壁的形成。孢子丝菌中CFEM结构域的扩增表明其可能在内皮细胞粘附、应激反应、从宿主获得铁的能力和细胞壁完整性中起作用［65-67］。真菌含有LysM结构域的蛋白质能结合碳水化合物［68］，如LysM与几丁质分子结合，通过掩蔽细胞壁几丁质分子帮助免疫逃避［69］。LysM结构域也可能在免疫逃避中起作用，保护酵母免受吞噬和细胞内杀灭，尚需要进一步的研究来验证LysM结构域在人类病原真菌中的作用。

铁是一种重要的金属，获取铁的还原途径和铁载体介导的途径均与真菌的致病力相关［70］。毛霉菌属（Mucor sp.）中从宿主中获取铁是建立感染的重要机制，高亲和力铁离子渗透酶（FTR1）、多铜氧化酶和亚铁氧化酶对与铁的获取对真菌毒力是必不可少的［70-71］。另外，除了铁还原途径，铁载体介导的机制是真菌中铁吸收的另一种主要模式［67］。在念珠菌中，铁载体运输相关基因参与铁的摄取，有助于念珠菌的侵袭以及逃避巨噬细胞的吞噬［67，72］。Prakash等［64］观察到铁获取的基因在孢子丝菌属中是保守且有扩增，提示这些基因在孢子丝菌中可能起到增强真菌毒性的作用。

真菌蛋白酶是真菌入侵宿主组织所必需的［73］。编码丝氨酸蛋白酶如脯氨酰寡肽酶（S09）、丝氨酸羧肽酶（S28）和二肽基肽酶（S15）的基因在孢子丝菌表达增加。脯氨酰寡肽酶具有胞外降解、蛋白质成熟和液泡蛋白酶的作用。丝氨酸羧肽酶和二肽基肽酶的功能在真菌中尚不清楚［74］。除了真菌蛋白酶外，分泌型脂肪酶在孢子丝菌中也有扩增。孢子丝菌的分泌性蛋白酶和脂肪酶可能通过帮助它们粘附在上皮细胞和组织降解上产生毒力导致感染的传播［75］。预测孢子丝菌属中的转运蛋白家族是MFS（major facilitator superfamily）转运蛋白家族，寡肽转运蛋白（oligopeptide transporter，OPT）家族和ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白。ABC和MFS转运蛋白在脂肪酸代谢等各种生理条件下发挥重要作用，作为外排泵在真菌耐药性中发挥重要作用。OPT家族转运体和MFS转运体的亚类，如糖转运体，对形态发生和毒力等细胞生物功能至关重要［76］。

本课题组利用RNA-seq鉴定了17 307个基因，其中11 217个被归类为蛋白质编码基因，6 090个被归类为非编码RNA（ncRNAs），标注的基因中大约有71%的基因发生了重叠，以不同链重叠型最为常见，基因表达分析显示有8 795个基因在双相转化中受到不同的调控，有一半以上的基因在酵母相中的表达被上调［58］。这项研究描述了5 929个长链非编码RNA（lncRNAs），这些基因座占申克孢子丝菌基因组中全部基因的34%以上。其中大多数发现的lnc RNAs为天然反义转录本（natural anti⁃sense transcripts，NATs）。NATs分为转录于靶基因基因座的反链DNA的顺式NATs（cis-NATs）和转录于不同基因座的反式NATs（trans-NATs），NATs通过与蛋白质编码或非编码的转录本相互作用，从而调节基因的表达［77］。报道表明许多cis-NATs是子囊菌和担子菌中基因表达的重要调节剂［78］。该研究公布了申克孢子丝菌全转录组数据和建立了基因组数据库（http：//sporothrixgenomedatabase.unime.it/），为真菌致病的分子机制研究提供强有力的理论基础。