阿尔茨海默病血液蛋白标志物的研究进展

徐 俊

（首都医科大学附属北京天坛医院神经认知科，北京100070）

阿尔茨海默氏病（Alzheimer's disease，AD）是以淀粉样蛋白沉积（amyloid-β，Aβ）和Tau蛋白形成的神经纤维缠结为主要病理特征的进行性中枢神经系统退行性疾病。该病目前的发病机制不明，临床上尚无有效的治愈药物。2011年，美国国立老年研究所-阿尔茨海默病协会（National Institute on Aging-Alzheimer's Association，NIA-AA）在AD诊断指南中指出AD是连续发展的疾病，在认知损害出现的至少10年之前AD患者脑内就已有相关病理改变（称为临床前期）［1］。这一指南促进了早期识别AD病理的生物标志物研究，并促进对AD进行早期诊断和干预的研究转向。脑脊液（cere⁃brospinal fluid，CSF）和正电子发射计算机断层显像（positron emission computed tomography，PET）检查能够反映脑内Aβ和Tau蛋白病理，多年来一直被推荐作为AD的特异性病理生物标志物，是AD的早期诊断、临床研究和药物研发中所监测的指标之一。2018年，NIA-AA推荐基于＂A＂（Aβ）＂T＂（Tau）＂N＂（神经变性）病理标志物划分AD和非AD谱系疾病，再次肯定了CSF和PET检查对AD诊断的意义［2］。但CSF和PET检测技术因价格昂贵，创伤性大，技术要求高，患者依从性差等缺点而无法在临床中普及［3］，因此目前临床上主要结合临床表现和认知量表对AD进行诊断，特异性较低。

血液因具有易于采样、安全性高、可重复实施、适于疾病追踪随访等优点，研究者们一直尝试在其中寻找到经济有效的AD早期生物标志物，以期打破AD目前面临的诊疗困境。然而，既往关于血液中AD蛋白生物标志物（主要是Aβ和Tau）与AD病理标志物（CSF和PET）的相关性研究、血液中Aβ和Tau对AD的诊断和预测等方面的研究结果并不一致［4–9］。主要的原因包括［10］：①脑源性Aβ或Tau在外周血中的浓度较低，传统的酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测范围有限；②血液中Aβ和tau可能还来源于外周组织；③血浆中其他含量丰富的蛋白质如白蛋白、免疫球蛋白会影响检测结果；（4）Aβ或Tau蛋白在血液中的半衰期较短。此外，种族差异和样本量的大小，纳入和排除的标准不同也会对研究结果产生影响［11-12］。近年来，超灵敏检测技术如单分子免疫列阵（single-molecule array，Simoa），免疫沉淀-质谱联 用（immunoprecipitation mass spectrometry，IPMS），MSD（Meso Scale Discovery，MSD）电化学发光，免疫磁减量（immunomagnetic reduction，IMR）的应用使得血液中AD蛋白标志物研究有了极大的进展。相关研究结果表明血液中部分生物标志物（如Aβ、p-Tau、外泌体）能够早期反映AD的病理状态，并对AD进行早期诊断和预测，有望于成为AD早期特异性体液生物标志物。因此本文通过对近5年来血液中AD蛋白生物标志物的研究进展进行总结，以提高对血液生物标志物在AD诊疗中的认识，并为其更好的早期应用于临床提供指导。

1 血浆Aβ检测

1.1 血浆Aβ对AD的诊断

与单独血浆Aβ42相比，通过Simoa检测的血浆Aβ42/Aβ40对AD的诊断更为可靠。在瑞典神经退行性疾病早期可靠的生物标志物（Biomarkers For Identifying Neurodegenerative Disorders Early and Reliably，BioFINDER）队列中的一项大型回顾性研究表明［13］，与轻度认知障碍（mild cognitive impair⁃ment，MCI）和对照组相比，Simoa检测的血浆Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40在AD患者中均明显下降，但仅血浆Aβ42/Aβ40在对照组和MCI组间有显著差异。Startin等［14］应用Simoa比较不同患者的血浆Aβ，研究发现唐氏综合征（Down syndrome，DS）患者的血浆Aβ42与散发性AD（sporadic AD，sAD）和对照组相比明显升高，sAD与对照组间的血浆Aβ42无明显差异性；但DS和sAD的血浆Aβ42/Aβ40均显著低于对照组。

在应用IMR检测血浆Aβ和Tau蛋白的研究中发现［15–19］，与对照组相比，MCI和AD患者的血浆Aβ42和Tau蛋白水平显著升高，血浆Aβ40水平降低。进行受试者工作特征曲线（receiver operating char⁃acteristic curve，ROC）分析表明，单独血浆Aβ42、Tau，或者联合生物标志物Aβ42/Aβ40、Tau×Aβ42对于区分对照组和AD的曲线下面积（area under curve，AUC）均大于90%，但这些指标区分MCI和AD的AUC仅在70%左右。一项纳入83例血液生物标志物的临床研究进行Meta分析表明［20］，与Simoa和ELISA相比，IMR检测的血浆Aβ42、Aβ40以及Aβ42/Aβ40在AD和对照组间均有显著差异性。可以看出，相比于Simoa，IMR检测的血浆Aβ对诊断AD的准确度似乎更高。但在这些研究中，AD的诊断缺乏Aβ或Tau病理标志物，因此仍需在有AD病理标志物的队列中进一步研究血浆Aβ对AD以及AD临床前期的诊断价值。

值得注意的是，IMR检测的血浆Aβ42水平往往是增加的，这与Simoa，IP-MS检测相关的研究结果相反，原因可能在于检测分析的过程不同［16-17］。首先，SIMOA采用磁珠纯化目标蛋白（此过程通常会导致目标蛋白丢失），而IMR是直接测量目标蛋白；其次，Simoa在检测中使用两种单克隆抗体，而IMR在检测中只用一种特异性捕获C端的抗体，这使得IMR会将血浆中Aβ42的单体，寡聚体、复合体等均检测出来。

1.2 血浆Aβ与AD病理标志物的相关性

在MCI和AD患者中，Smioa和IMR检测的血浆Aβ与CSF/PET中的AD病理标志物存在一定相关性，但其区分脑内异常AD病理状态的能力有待进一步验证。Janelidze等［13］通过Simoa检测受试者血浆中的Aβ，结果表明MCI者的血浆Aβ42与CSF中的Aβ42轻度正相关（r=0.27，P＜0.001），与AβPET轻度负相关（r=-0.295，P=0.002）。另一项应用Si⁃moa检测血浆中Aβ的研究指出［21］，遗忘型MCI（amnestic MCI，aMCI）患者的血浆Aβ42/Aβ40与CSF Aβ42/Tau的正相关性高于对照组（raMCI=0.51＞r对照=0.25）；血浆Aβ42/Aβ40预测aMCI患者脑内AβPET异常状态的AUC为0.86。Teunissen等［18］在荷兰和瑞典两组队列的AD患者中发现，IMR检测的血浆Aβ42和ELISA检测的CSF Aβ42中度负相关（r=-0.352）。在一项中国台湾地区AD神经影像学计划多 中 心 研 究 中［22］，IMR检 测 的 血 浆Aβ42以15.58 pg/mL为分界值，结合APOEε4状态，区分早期AD患者脑内Aβ异常沉积状态的能力明显提高（AUC单独=0.611；AUC联合=0.875）。

与Simoa和IMR相比，IP-MS检测的血浆Aβ能够较为准确的反映认知正常者、MCI以及AD患者的脑内Aβ沉积水平［23］。应用IP-MS对华盛顿医科大学AD研究中心的41例AD患者和认知正常者的血浆Aβ进行检测，结果表明血浆Aβ42/Aβ40反映CSF和PET检查中的Aβ异常状态的AUC为89%；进一步将该比值与CSF标志物进行相关性分析发现，血浆与CSF中的Aβ42/Aβ40高度相关（r=0.7，P＜0.000 1）［24］。Kaneko等［25］采用IP-MS检测66个受试者血浆中淀粉样前体蛋白（amyloid precursor pro⁃tein，APP）和Aβ，结果显示血浆APP669-711/Aβ42区分AβPET异常状态的能力（AUC=0.969）优于Aβ42/Aβ40（AUC=0.798）。之后该研究团队在日本国立老年医学中心（National Center for Geriatrics and Gerontology，NCGG）和澳大利亚老龄化影像学，生物标志物和生活方式研究（Australian Imaging，Bio⁃marker and Lifestyle Study of Ageing，AIBL）数据库中的研究再次证实血浆Aβ42/Aβ40，APP669-711/Aβ42以及他们的复合生物标志物均能作为检测AβPET状态的有效指标（AUC＞90%）［26］。

1.3 血浆Aβ对认知进展的预测

部分SCD和aMCI患者脑内可能出现AD早期病理变化因而更有可能出现认知功能恶化［27］，而Simoa和IMR检测的血浆Aβ与AD病理标志物存在相关性从而能够在一定程度上预测认知水平的下降。Verberk等［3］对248例主观认知下降者（sub⁃jective cognitive decline，SCD）平均随访3年，并应用Simoa对其血浆中的Aβ进行检测，建立Cox比例风险回归模型后发现，在调整年龄和性别因素后，血浆Aβ42/Aβ40比值下降的SCD进展为MCI和痴呆的风险增加1.67倍（95%CI：1.15-2.44），然而血浆Aβ42、Aβ40以及Tau并不能预测MCI和痴呆的进展。Chen等［28］对22例aMCI患者平均随访1.5年，结果表明在调整年龄、性别、文化程度、APOE因素后，IMR检测的血浆Aβ42、Tau或者Tau×Aβ42升高至少增加5倍以上的认知功能下降的风险。

2 血浆Tau检测

2.1 血浆Tau对AD的诊断

2.1.1 血浆t-Tau在AD中的诊断AD患者和正常人群中的血浆总Tau蛋白（total-Tau，t-Tau；前文中所提到的血浆Tau即指t-Tau）重叠程度较高，并不能作为AD的特异性生物标志物，但可反映病情的进展程度。应用Simoa检测的血浆t-Tau虽在AD患者中显著升高，但并不能有效的区分AD和MCI及认知正常人群［29–31］。而Yang等［32］采用IMR检测台湾大学医院215例招募者的血浆t-Tau，结果显示在17.43 pg/mL的分界值下，血浆t-Tau能够区分痴呆与认知正常者（AUC=90.8%），但并不能有效区分AD和非AD痴呆。

2.1.2 血浆p-Tau在AD中的诊断 近来，血浆中过度磷酸化的Tau蛋白（phosphorylated tau，p-Tau）作为AD血液生物标志物逐渐受到关注，目前研究较多的磷酸化位点有p-Tau181和p-Tau217，也有关于血浆p-Tau231在AD中的研究报道［33-34］。

血浆p-Tau181和p-Tau217在MCI阶段乃至临床前期即显著升高，对于AD的早期诊断和鉴别诊断均具有良好的区分性能。采用IMR对73例受试者血浆p-Tau181进行检测，结果表明在不同的分界值水平，血浆p-Tau181能够识别认知正常者、MCI以及轻度AD患者［35］。应用Simoa和MSD检测血浆p-Tau181的研究发现［36–39］，血浆p-Tau181在Aβ+的MCI和对照组中明显升高，在AD阶段随着病情进展进一步增加，对鉴别临床诊断或病理解剖证实的AD与非AD退行性疾病的AUC在90%左右。Palmqvist等［40］率先应用MSD对不同队列人群中的血浆p-Tau217检测发现，血浆p-Tau217对于区分亚利桑那州神经病理队列和BioFINDER队列中的AD和其他神经变性疾病的AUC超过95%。应用MSD对华盛顿高地-英伍德哥伦比亚老龄化项目（Washington Heights-Inwood Columbia Aging Project，WHICAP）中的3个种族人群的血浆p-Tau进行检测发现［41］，血浆p-Tau217和p-Tau181能够有效区分解剖和临床队列中的不同种族的AD和对照组。

2.2 血浆Tau与AD病理的相关性

2.2.1 血浆t-Tau与AD病理标志物的相关性 AD

患者中Simoa检测的血浆t-Tau和CSF中AD标志物的相关性微弱，并不能成为AD特异的病理标志物，但能够反映神经损伤的严重程度。在梅奥临床队列（Mayo Clinic Study of Aging，MCSA）中的研究表明，血浆t-Tau升高与认知水平下降，海马体积缩小以及皮层厚度减少有关，但与脑内Aβ沉积、神经纤维缠结病理并不相关［29，42-43］。一项对AD神经影像学计划（Alzheimer's Disease Neuroimaging Initia⁃tive，ADNI）数据库中的189例认知正常、195例MCI和179例AD患者在2年内的血浆t-Tau变化的回顾性研究分析表明［30］，在调整诊断、年龄、性别、文化程度、APOE后，血浆t-Tau升高与认知进展速度，海马萎缩程度以及葡萄糖代谢下降水平有关；研究人员同时在对BioFINDER队列人群中发现AD患者的血浆t-Tau与CSF t-Tau的相关性并不强（β=0.13，95%CI：0.039-0.22）。在纽约大学医学院（New York University School of Medicine，NYUSOM）队列中的一项研究也同样显示AD患者的血浆和CSF中的t-Tau无明显相关性（r=0.2，P=0.33）［31］。

2.2.2 血浆p-Tau与AD病理的相关性 在脑内出现AD病理之前，血浆p-Tau181和p-Tau217水平已有升高，二者与Aβ和Tau病理密切相关，能够准确反映AD病理。对痴呆病例登记（Dementia Case Register，CDR）和英国阿尔茨海默病研究（Alzheim⁃er's Research UK，ARUK）队列中的115人的血浆p-Tau181采用Simoa进行检测，并对参与者去世后进行神经病理评估，研究表明AD病理出现的至少8年之前血浆p-Tau181就有升高，区分AD病理和非AD病理的AUC达97%［44］。在ADNI数据库中的一项关于血浆p-Tau181（Simoa检测）在AD病程中的变化情况的纵向研究中，研究者采用线性混合效应模型分析表明在AβPET和CSF Aβ42达到异常水平之前，血浆p-Tau181即随着Aβ病理的进展而升高，并且在调整了年龄，性别，认知状态后，Aβ+组中血浆p-Tau181的纵向增加与6年后Tau蛋白的广泛聚集相关［45］。在应用Simoa和MSD检测血浆p-Tau181的横断面研究中发现，仅在Aβ+组（不论认知状态）中血浆p-Tau181与CSF p-Tau以及Tau PET有显著相关性［34，36–38，42，46］。Palmqvist等［40］关于MSD检测的血浆p-Tau217与AD病理的相关性研究表明，在尸检病理证实的Aβ+组中血浆p-Tau217与神经缠结的密度评分相关（r=0.64，P＜0.001）；该团队在BioFINDER队列中的研究发现，血浆p-Tau217对识别Aβ/Tau PET异常状态的能力可比拟CSF中的AD标志物（AUC血液p-Tau217：0.87-0.93；AUCCSF：0.80-0.97）。对来自华盛顿大学招募的AD患者和健康对照者进行AβPET和CSF检查，并应用IP-MS检测受试者血浆中的p-Tau，研究表明血浆和CSF中的p-Tau217高度相关（r＞0.7，P<0.000 1），ROC分析结果显示血浆p-Tau217对识别AβPET异常状态的AUC超过90%［47］。

2.3 血浆Tau对认知进展的预测

Janelidze等［36］对219例认知正常者和125例MCI患者随访8年，以是否转化为AD为结局指标建立Cox比例风险回归模型，结果表明在调整血浆t-Tau，Aβ42/Aβ40，神经丝轻链等因素后，高血浆p-Tau181增加非痴呆者转化为AD的风险（HR：3.59，95%CI：2.55-5.04）。Palmqvist等［40］在哥伦比亚常染色体显性AD登记注册研究队列中发现在PSEN1变异的AD患者至少在出现认知损害的20年前血浆p-Tau217即有升高。随后该团队对BioFINDER队列中的250位受试者随访6年，使用线性混合效应模型分析表明，在Aβ+的认知正常者和MCI人群中血浆p-Tau217随着时间而增加，并且与认知能力 下 降 和 脑 萎 缩 相 关［48］。Brickman等［41］对WHICAP临床队列中的169例认知正常者进行随访，研究表明在调整性别、年龄、种族和APOE因素后，血浆p-Tau217和p-Tau181升高增加4年后AD的发生风险（OR：2.27，95%CI：1.31-3.93；OR：2.74，95%CI：1.54–4.86）。

3 血液外泌体检测

外泌体是包括神经元在内的多种细胞所分泌的直径为30～150纳米的囊泡结构，其可于血液、脑脊液、尿液等多种体液中分离、提取。外泌体内含有大量蛋白质、脂质、微小RNA（microRNA，miR⁃NA）等来自母体细胞的内容物，因此可以作为反映中枢系统疾病的生物标志物［49］。目前外泌体在AD方面的研究主要通过对其中的AD相关蛋白（Aβ、Tau、突触蛋白等）和miRNA进行检测。

现有的研究提示血液外泌体中的部分蛋白质可以早期识别AD并且能够准确反映AD病理变化。通过ELISA检测的外泌体Aβ、Tau、p-Tau181在AD临床前期明显升高，并且联合生物标志物对区分AD、aMCI和对照组的能力优于单一标志物［50-51］。在我国的一项探究血液中神经源性外泌体（ELISA检测）和CSF中AD标志物的一致性的多中心研究中发现，血液外泌体和CSF中的Aβ42，t-Tau，p-Tau181彼此高度相关（R2=0.76-0.86，P＜0.000 1）［51］。新近的研究发现血液外泌体中的突触蛋白组合能在临床症状出现的5~7年前预测AD的发生（AUC=0.87-0.89）［52］。

4 血液其他蛋白检测

除了上述血液中主要的AD相关蛋白标志物外，还有研究利用高通量质谱分析对血液中的蛋白检测，结果表明多种血液蛋白指标联合往往能够提高作为AD生物标志物的准确性。在韩国AD早期诊断和预测的脑衰老研究队列中的一项基于质谱检测的蛋白组学分析表明，多个蛋白生物标志物组合可以提高对AD诊断的敏感性和特异性［53］。我国学者［54］对AD患者和对照组血清进行蛋白组学分析，选取了与APP相互作用的18个蛋白作为AD候选生物标志物，推测这些蛋白表达水平或功能改变可能影响Aβ代谢从而参与AD发生［53］。

综上所述，应用超灵敏技术检测的血浆中Aβ和p-Tau以及血液外泌体与AD病理标志物之间存在明显相关性，能够早期识别AD病理；联合生物标志物检测能够增加对AD早期诊断的准确性并能在一定程度上预测痴呆的进展，有希望成为AD早期生物标志物。但不同的检测技术在血液中AD蛋白标志物方面的研究结果存在一定差异性，除了检测技术原理不同之外，检测流程、不同标志物的分界值，以及不同种族、样本量大小、纳入标准都会对结果产生影响。因此需要对AD蛋白标志物的不同检测方法和流程以及纳入的人群标准作以规范，也需要更多的Meta分析和建立以“前瞻性、多种族、多中心、大样本、真实世界数据”为基本特征的认知队列以明确血液蛋白标志物在AD中的应用价值，从而推动AD血液蛋白标志物早期应用于临床。