苦参碱对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞成纤维细胞生长因子2的调控作用

段秀萍　何赟　梁靖梅　李福记　廖蕴华

[关键词] 苦参碱;成纤维细胞生长因子2;人腹膜间皮细胞;上皮间充质转分化;TGF-β1

[中图分类号] R563          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）18-0015-04

Regulation effect of matrine on fibroblast growth factor 2 induced by TGF-β1 in human peritoneal mesothelial cells

DUAN Xiuping   HE Yun   LIANG Jingmei   LI Fuji   LIAO Yunhua

Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning   530021， China

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effect of matrine on fibroblast growth factor 2 （FGF-2） during epithelial mesenchymal transition （EMT） of peritoneal mesenchymal cells. Methods Human peritoneal mesothelial cells were divided into three groups according to different treatment methods （the control group， the TGF-β1 stimulation group and the TGF-β1+0.8 mg/mL matrine treatment group）. The complete medium containing 5 ng/mL TGF-β1 was used in the TGF-β1 stimulation group， and the complete medium containing 5 ng/mL TGF-β1 and 0.8 mg/mL matrine was used in the treatment group. The control group was completely cultured with the same amount， and after 48 h of intervention treatment， the mRNA expression level of FGF-2 was analyzed by mRNA-seq. Finally， the mRNA and protein expression levels of FGF-2 in human peritoneal mesothelial cells were detected by relative real-time fluorescence quantitative PCR and western blot. Results It was found that 5 ng/mL of TGF-β1 could up-regulate the expression levels of FGF-2 mRNA and protein when stimulating human peritoneal mesothelial cells （6.18 times mRNA and 2.00 times protein）. After matrine intervention， the mRNA and protein expression levels of TGF-β1-induced FGF-2 gene were significantly down-regulated （mRNA and protein were down-regulated by 4.30 times and 1.77 times respectively）. Conclusion By inhibiting fibroblast growth factor 2， matrine prevents fibroblast from accumulating in peritoneal membrane， and finally prevents the occurrence of peritoneal fibrosis.

[Key words] Matrine; Fibroblast growth factor 2; Human peritoneal mesothelial cells;Epithelial-mesenchymal transition; TGF-β1

腹膜透析是尿毒癥患者的主要替代治疗手段之一[1]，其经济方便，可居家进行，此外，还可以保护残存的肾功能且对血流动力学影响小，目前广泛应用于临床[2]。近年来腹膜透析人数不断增长，然而透析最主要的并发症是腹膜纤维化，会导致腹膜透析的失败。目前缺乏有效防止腹膜纤维化发生的药物;此外，腹膜纤维化发生的分子病理机制尚不明确，但有研究表明，TGF-β1作为纤维化的一个关键因子[3]，在腹膜纤维化中也起着重要的作用。在活体实验中，构建含TGF-β1的腺病毒并将其注射到动物中，结果显示其能诱导动物发生腹膜纤维化，且纤维化与透析相关性腹膜纤维化相类似[4]。

成纤维细胞生长因子2（Fibroblast growth factor 2，FGF-2）是一种成纤维细胞生长因子，参与多种细胞的增生和分化。在哺乳动物中存在18种FGF，根据其序列的同源性和产生的不同分为6个亚族，其中FGF-2为第一亚族，目前研究比较广泛的也是FGF-2，其可诱导内皮细胞和成纤维细胞等细胞增殖;除此之外，其还是一种趋化因子，其对星形胶质细胞、内皮细胞和成纤维细胞等有趋化作用[5]。近年来研究发现，FGF-2与肾脏和肺脏等多种器官纤维化密切相关[6-8]。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验使用的人腹膜间皮细胞（Human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）、苦参碱和FGF-2单克隆抗体分别购于广州吉赛科技有限公司、北京博奥拓达科技有限公司和abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  按细胞培养方法复苏HPMCs细胞，待细胞长至80%～90%后传代细胞，传代细胞待其状态良好后，消化细胞并将其接种到6孔板，待其长至70%左右开始干预实验。根据实验的不同处理方法将HPMCs细胞分为三组（对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组），具体方法如下：对照组采用等量的完全培养基，TGF-β1刺激组采用5 ng/mL的TGF-β1处理细胞，0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组采用5 ng/mL的TGF-β1刺激细胞并同时给予0.8 mg/mL苦参碱干预处理细胞。

1.2.2 蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR  ①蛋白免疫印迹：根据实验的不同处理方法对HPMCs细胞处理48 h后，提取HPMCs细胞的总蛋白，BCA试剂盒测定提取蛋白的浓度，加入上样缓冲液并煮沸使蛋白变性后，配置分离胶和浓缩胶，上样后用小电压压平，然后加大电压于聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离蛋白，根据Marker切胶并将胶上蛋白转至PVDF膜，使用抗原封闭液封闭抗原1 h后，加入一抗，在4℃的冰箱孵育过夜，吸出一抗，PBST溶液洗涤3次，加入二抗于抗体孵育盒中孵育1 h，最后加入曝光液，在成像系统中拍照获取蛋白条带。②实时荧光定量PCR：根据实验的不同处理方法对HPMCs细胞处理48 h后，PBS洗涤细胞2次后，使用天根生化科技有限公司的RNA抽提试剂盒，按照说明书提取HPMCs细胞总RNA，检测其纯度与浓度，使用Takara公司的逆转录试剂盒将提取好的RNA逆转录为单链DNA（即cDNA），再以cDNA作为模板，与Takara公司的荧光试剂盒配成20 μL的反应体系，然后在实时荧光定量PCR仪运行反应体系，最后根据CT值使用公式计算相对mRNA的表达量;RT-PCR过程中使用的引物通过Pubmed数据库中在线设计软件进行设计，获得引物序列后发送至公司合成。具体序列见表1。

1.2.3 转录组分析  mRNA-seq分析人腹膜间皮细胞干预处理48 h后收集细胞，使用干冰将细胞寄往公司进行转录组测序分析。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 20.0统计学软件处理，对对照组、TGF-β1刺激组及TGF-β1+0.8 mg/mL苦参碱处理组的mRNA和蛋白表达水平的数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间数据比较使用单因素方差进行分析，组间比较使用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转录组测序分析FGF-2基因的mRNA表达水平

按照分组（对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组）处理细胞48 h后提取细胞总RNA送公司进行转录组测序，测序结果显示TGF-β1刺激HPMCs细胞后能上调FGF-2的mRNA表达，而苦参碱干预处理HPMCs细胞后使FGF-2的mRNA表达下调。见表2。

2.2 实时荧光定量PCR检测FGF-2的mRNA的表达水平

按照分组（对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+ TGF-β1处理组）处理细胞48 h后，实时荧光定量PCR检测各组HPMCs细胞FGF-2的mRNA表达情况。结果与转录组测序分析基本相符，TGF-β1刺激HPMCs细胞后会显著上调FGF-2的mRNA表达，给予苦参碱处理后FGF-2的mRNA表达显著下调。见表3。

2.3 蛋白免疫印迹检测FGF-2的蛋白表達水平

根据实验的不同处理方法将HPMCs细胞分为三组（对照组、TGF-β1刺激组及0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组），按预设的实验方法对各组HPMCs细胞处理，干预后培养48 h，蛋白免疫印迹检测各组HPMCs细胞FGF-2的蛋白表达情况。结果显示，TGF-β1刺激组FGF-2的蛋白表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），0.8 mg/mL苦参碱+TGF-β1处理组FGF-2的蛋白表达水平显著低于对照组，差异有显著统计学意义（P<0.01）。见图1、表4。

3 讨论

腹膜纤维化是腹膜透析患者最为严重的并发症，如何有效防治腹膜纤维化是维持长期腹膜透析的关键。腹膜纤维化发生的分子病理机制目前尚不明确;但大量研究认为，TGF-β1与腹膜纤维化的发生与发展密切相关[3，9-11]。Wu等[10]在发生腹膜纤维化的腹膜组织中检测到TGF-β1的高表达;Duan等[9]研究显示，TGF-β1能诱导小鼠腹膜间皮细胞发生EMT;此外，前期研究数据显示，TGF-β1刺激HPMCs细胞后会使其E-cadherin的mRNA表达下调，而使其α-SMA的mRNA表达上调，证实TGF-β1也能诱导HPMCs细胞发生EMT[12]。根据以上研究结果可以推测，TGF-β1在HPMCs细胞EMT及腹膜透析相关性腹膜纤维化中具有重要的作用。有研究显示，FGF-2与公认的致纤维化因子TGF-β1具有明显的正反馈调节作用[7]，更为有趣的是，有研究认为TGF-β1作用的发挥与FGF-2密切相关[13]。本研究采用TGF-β1诱导HPMCs细胞发生EMT并通过mRNA-seq分析发现，FGF-2的mRNA表达水平显著上调;进一步验证结果显示，TGF-β1刺激HPMCs细胞后能显著上调FGF-2蛋白的表达水平。FGF-2作为一种成纤维细胞生长因子，近年来许多研究报道了其在肾脏和肺脏等多种器官纤维化中占据有重要的作用[6-8]，本研究结果显示，FGF-2与HPMCs细胞的EMT和腹膜纤维化有着密不可分的关系。

此外，本研究結果还显示，苦参碱对HPMCs细胞FGF-2蛋白和mRNA的表达水平具有显著的抑制作用。苦参碱是生物碱的一种，具有镇痛解热、调节免疫力、抑制细菌生长、抗病毒等功效。相关研究表明，苦参碱在许多器官纤维化中具有显著的抗纤维化作用[14-16]。目前，苦参碱在抗人腹膜纤维化作用方面的研究报道相对较少，而本研究结果提示苦参碱可能通过调控FGF-2的表达水平，进而抑制腹膜间皮EMT，防止腹膜纤维化的发生。

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（收稿日期：2021-03-15）