川芎嗪对脓毒症小鼠肝组织铁调素的表达调控及机制研究

张益维 王珏 朱浩 黄长顺 杨秋红

脓毒症是由于感染或创伤引起的全身进行性免疫炎症反应，严重威胁患者生命[1-2]。脓毒症所导致的全身炎症因子分泌对肝功能影响较为严重，使得肝脏分泌铁调素，从而出现铁负荷，加重炎症反应[3-4]。临床上关于脓毒症治疗的药物种类繁多，且不同药物的有效性和安全性评价仍存在争议。近年来，有动物试验将川芎嗪应用于脓毒症抗炎治疗，取得一定成果。川芎嗪已被证实具有调节免疫、抵抗炎症、清除氧自由基等功能[5]，常被用于闭塞性脑血管疾病的治疗，但其在脓毒症小鼠中的抗炎作用及与调控铁调素表达之间的关系尚不清楚。因此，笔者采用肠穿孔手术（CLP）制备脓毒症小鼠模型，并采用盐酸川芎嗪和铁调素抑制剂进行治疗，探索川芎嗪对脓毒症小鼠铁调素表达的调控机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性8周龄野生型C57BL/6J小鼠44只[上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，合格证号：20170005013227]，体重19～22 g。高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；超声波细胞破碎仪[冠森生物科技（上海）有限公司，型号LCD150N]；盐酸川芎嗪注射液（河南福森药业有限公司，国药准字：H20056061，10 ml∶40 mg）；铁调素抑制剂（DS28120313）（中国 MCE 公司，批号：HY-107980）；ELISA试剂盒（中国联科生物）；磷酸化JAK（p-JAK）试剂（美国 CST 公司，批号：3230s），磷酸化 STAT（p-STAT）试剂（英国 Abcam 公司，批号：ab68153）。本研究经宁波市第一医院动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 分组 按随机数字表法分为假手术组、CLP组、CLP+铁调素抑制剂组和CLP+川芎嗪组，每组各11只。

1.2.2 模型制备 各组小鼠术前12 h禁食、禁水，采用4%水合氯醛麻醉后于腹中线处切开1 cm左右，游离盲肠并进行末端结扎，用16号针在盲肠末端0.5 cm处穿刺并挤出少许粪便后缝合。假手术组小鼠只开腹不结扎盲肠。

1.2.3 模型评价[6]术后12 h取1只CLP小鼠测定血液载菌量和腹腔液载菌量进行模型评价。血液载菌量：在麻醉条件下取眼眶血0.2 ml，EDTA抗凝处理后取50 μl加入0.9%氯化钠注射液中进行倍比稀释10、100、1 000倍（50 μl血液加入 0.9%氯化钠注射液中进行10倍比稀释至500 μl，再取其中50 μl进行10倍比稀释至500 μl，再取其中50 μl进行10倍比稀释至500 μl），分别取1 ml均匀涂在两个胰蛋白酶血平皿上；将平皿置于37℃恒温培养箱进行培养，12 h后计算平板上菌落数。每毫升血液中载菌量=同一稀释度两个血平皿上菌落的平均数×稀释倍数×10。腹腔液载菌量：麻醉条件下消毒小鼠腹部皮肤，将2 ml无菌纯水缓缓注入小鼠腹腔，轻轻按摩1 min后，缓慢抽出，所得腹腔灌洗液取100 μl加入0.9%氯化钠注射液中进行倍比稀释 103、104、105倍（先取 100 μl腹腔液加入0.9%氯化钠注射液中进行103倍比稀释至100 ml，再取其中100 μl进行10倍比稀释至10 ml，再取其中100 μl进行10倍比稀释至10 ml），然后取 1 ml均匀涂布在两个胰蛋白酶血平皿上，将平皿置于37℃恒温培养箱进行培养，12 h后计算平皿上菌落数，计算方法同血液载菌量。

1.2.4 干预措施 造模术后12 h CLP+铁调素抑制剂组小鼠腹腔注射30 mg/kg DS28120313（溶于0.9%氯化钠注射液共2 ml）；CLP+川芎嗪组小鼠腹腔注射20 mg/kg盐酸川芎嗪注射液（溶于0.9%氯化钠注射液共2 ml）；假手术组和CLP组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液2 ml。观察各组小鼠术后4 d的生存情况。

1.2.5 血液生化指标、炎症因子水平检测 选取各组小鼠5只（除假手术组），于术后48 h取眼眶血0.2 ml，EDTA抗凝处理后，4℃，5 000 r/min离心 10 min，离心半径10 cm。取血清用血生化仪检测ALT、AST；采用ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6和铁调素水平。

1.2.6 肝组织JAK/STAT通路相关蛋白表达水平检测 采用Western blot法。于造模术后48 h，每组选取3只小鼠，采用颈椎脱臼法处死后取肝组织2 mg，加入 350 μl RIPA 裂解液（每 100 μl裂解液中加入 1 μl PMSF和2 μl磷酸化抑制剂），置于超声波细胞破碎仪进行组织裂解，离心后提取目的蛋白，BCA法进行蛋白定量后加入SDS loading buffer高温变性。肝组织蛋白经SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭60 min后，分别加入铁调素（稀释度1∶1 000），p-JAK、JAK（稀释度 1∶1 000）和 p-STAT、STAT（稀释度 1∶1 000），4℃冰箱中孵育过夜。次日，加入 HRP标记的二抗（1∶5 000）室温孵育 2h，洗膜 3次后行 ECL显色，并于暗室内曝光。采用Image J软件分析条带灰度值，以铁调素条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比较和p-JAK/JAK，p-STAT/STAT比值反映目的蛋白的相对表达水平和磷酸化水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型建立评估 假手术组小鼠术后12 h精神良好，活动轻微减少，肛温正常，饮食、饮水正常。CLP小鼠术后12 h时精神萎靡，行动迟缓，活动减少，肛温下降，饮食饮水减少，背部毛发竖立，尿液浑浊。假手术组小鼠术后12 h在血液和腹腔液中均未检测到细菌。CLP小鼠术后12 h血液和腹腔液载菌量分别为（15.0±1.3）×103/ml和（8.6±1.0）×103CFU/ml，提示CLP模型建立成功。

2.2 4组小鼠术后4 d内生存率的比较 假手术组小鼠术后4 d内无死亡，生存率为100%；CLP+铁调素抑制剂组和CLP+川芎嗪组小鼠CLP术后4 d生存率分别为 75.0%（6/8）和 87.5%（7/8），高于 CLP 组的0.0%（0/8），差异均有统计学意义（均P＜0.01）。死亡小鼠解剖发现腹腔充满浑浊渗出液。

2.3 3组小鼠血清生化指标及炎症因子水平的比较 CLP+铁调素抑制剂组与CLP+川芎嗪组小鼠术后48 h ALT、AST、TNF-α、IL-1、IL-6 和铁调素水平均显著低于CLP组，且CLP+川芎嗪组小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平显著低于CLP+铁调素抑制剂组，CLP+川芎嗪组铁调素水平高于CLP+铁调素抑制剂组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 3组小鼠血清生化及炎症因子水平的比较

2.4 3组小鼠肝组织JAK/STAT通路相关蛋白水平的比较 CLP+铁调素抑制剂组和CLP+川芎嗪组术后48 h铁调素蛋白表达水平表达量显著低于CLP组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而CLP+铁调素抑制剂组p-STAT和p-JAK蛋白表达水平与CLP组相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；CLP+川芎嗪组p-STAT和p-JAK蛋白表达水平显著低于CLP+铁调素抑制剂组和CLP组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表 2。

表2 3组小鼠肝组织JAK/STAT通路相关蛋白表达水平的比较（%）

3 讨论

脓毒症多是由感染或创伤引起的全身系统弥漫性炎症反应，炎症反应严重者可伴发器官功能障碍或衰竭，发病率和死亡率较高。机体的铁平衡能够显著影响患者对感染性疾病的易感性及预后。临床研究结果发现，脓毒症患者血清和尿液铁调素水平较对照组明显升高[7]。肝源性铁调素通过调节铁代谢在小鼠脓毒症中发挥重要作用，在铁调素低表达的肝脏疾病中，存在潜在治疗作用[8]。有研究发现，炎症反应和合适的铁调素水平与脓毒症患者预后密切相关[9]。目前研究表明，机体调控铁调素表达的主要有以下两条信号通路：正常生理情况下，铁幼素通过BMP/SMAD信号通路上调铁调素，而感染和炎症等病理等情况下，炎症因子IL-6通过JAK/STAT信号通路上调铁调素[10-11]。

川芎嗪具有活血通脉作用[12]，且现代医学已经从多方面证实了川芎嗪能够调节免疫功能，抵抗炎症，清除氧自由基。陈玉熹等[13]、缪心军等[14]在研究中发现，依达拉奉联合川芎嗪能够显著保护大鼠肝功能，治疗组大鼠术后ALT、TNF-α均显著低于假手术组，有抑制炎症反应和保护肝功能的作用，与本研究结果相似。本研究发现，川芎嗪能够有效提高CLP小鼠术后4 d生存率。采集3组小鼠术后12 h时眼眶血进行生化分析，发现川芎嗪能够有效保护小鼠肝功能，调节小鼠全身免疫反应。这些药理作用均可阻断或减轻脓毒症的病理生理过程，有利于脓毒症的防治。笔者推测可能是通过抗炎和调节免疫功能来提高脓毒症小鼠术后生存率的，并推测川芎嗪抑制IL-6的释放影响JAK/STAT通路蛋白磷酸化，从而抑制铁调素的表达，改善脓毒症小鼠预后。

铁调素是肝脏合成的具有广谱抗菌作用的蛋白，其升高或降低均会导致机体内铁的稳态失衡，当脓毒血症患者全身炎症反应加重时，肝脏功能受损，从而分泌铁调素，进而导致铁稳态失衡，铁负荷增加，从而加重机体的脂质过氧化[15]。有效降低铁调素的表达是防治脓毒症进行性加重的关键。本研究结果显示，川芎嗪能够有效降低小鼠CLP术后48 h血清铁调素水平。为了进一步证明川芎嗪的抗炎作用与铁调素相关，本研究分析了3组小鼠血清生化指标及炎症因子水平，结果发现CLP+铁调素抑制剂组小鼠术后48 h血清 ALT、AST、TNF-α、IL-1、IL-6 和铁调素水平均显著低于CLP组，且CLP+川芎嗪组小鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平显著低于CLP+铁调素抑制剂组，CLP+川芎嗪组铁调素水平高于CLP+铁调素抑制剂组，提示川芎嗪可能通过抑制炎症因子表达保护肝功能。为了进一步探究川芎嗪对铁调素调控在抗炎中的作用机制，本研究观察了3组小鼠肝组织中相应通路蛋白表达情况，川芎嗪能够显著降低CLP术后48 h小鼠肝组织中p-JAK和p-STAT蛋白的表达水平，而铁调素抑制剂则无法达到此效果，提示川芎嗪能够通过抑制铁调素上游p-JAK和p-STAT的表达，以达到抑制铁调素表达从而减轻炎症因子表达引起的炎症反应。而铁调素抑制剂仅通过抑制铁调素表达来减轻铁调素所引起后续肝组织氧化损伤，而无法对炎症通路进行直接抑制。这可能是川芎嗪对脓毒症治疗有效性的关键机制之一。

综上所述，川芎嗪能够通过抑制JAK/STAT磷酸化而减少铁调素在小鼠肝组织中的表达，从而减轻肝脏损伤及全身炎性损伤。