血清miRNA-16和miRNA-92a在2型糖尿病合并骨质疏松症患者中的表达及与骨代谢相关性研究

丁莉 彭健韫 张伟 陈日秋

近年来，我国2型糖尿病（T2DM）合并骨质疏松症发病率呈不断上升趋势。因此，探讨T2DM合并骨质疏松症的发病机制对临床诊治具有重要意义。miRNA是在转录后参与细胞增殖、凋亡及分化等过程的一种小型非编码RNA，存在于多种生物体内。研究报道显示，miRNA参与骨微环境中的骨吸收或骨生成[1-2]。本研究探讨血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨质疏松症患者中的表达及与骨代谢的相关性，以期为临床诊断和治疗T2DM合并骨质疏松症提供参考，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取丽水市人民医院2019年1月至2021年1月收治的T2DM合并骨质疏松症患者91例作为T2DM合并骨质疏松组，纳入标准：（1）符合《中国2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]中关于T2DM的诊断标准以及《中国人骨质疏松症建议诊断标准》[4]中关于骨质疏松症的诊断标准；（2）年龄40～75岁；（3）临床资料完整。排除标准：（1）1型糖尿病或其他骨科疾病者；（2）精神疾病者；（3）合并影响骨代谢疾病者。另选取本院同期收治的单纯T2DM患者80例作为非骨质疏松组，依据《中国2型糖尿病防治指南（2013年版）》[3]关于T2DM诊断标准。两组患者基线资料比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均知情同意。

表1 两组患者基线资料比较

1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。主要仪器：实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，电化学发光全自动免疫分析仪购自瑞士罗氏公司。

1.3 血清miRNA-16和miRNA-92a表达水平检测 （1）miRNA提取、纯化和定量分析：采集受试者外周静脉血5 ml，15 000 r/min离心6 min，收集血清后于4℃12 000 r/min离心6 min，再收集血清置于-70℃保存待测。（2）血清miRNA-16和miRNA-92a相对表达量测定：取上述血清标本，采用TRIzol试剂提取血清总RNA，取5 μl总RNA进行琼脂糖凝胶电泳并检测总RNA的纯度和完整度。按照美国Biomiga公司逆转录试剂盒使用说明书将其逆转录为cDNA，以U6作为内参基因。取cDNA进行qRT-PCR，反应条件：95 ℃预变性 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共完成40个循环，每个样品设置3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算miRNA-16和miRNA-92a相对表达量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表2。

表2 引物序列

1.4 血清骨代谢指标测定 采集两组患者外周静脉血 5 ml，15 000 r/min离心 6 min，取上清液（血清）置于-70℃下保存待测。采用电化学发光免疫分析法测定Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊系列（β-CTX）和ALP水平，严格依据试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC曲线分析miRNA-16和miRNA-92a对T2DM合并骨质疏松症的诊断效能；采用Pearson相关分析miRNA-16、miRNA-92a与骨代谢的相关性；多因素logistic回归分析影响T2DM合并骨质疏松的独立危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miRNA-16和miRNA-92a相对表达量比较 T2DM合并骨质疏松组miRNA-16和miRNA-92a相对表达量均明显高于非骨质疏松组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 3。

表3 两组miRNA-16和miRNA-92a相对表达量比较

2.2 两组β-CTX、ALP水平比较 T2DM合并骨质疏松组β-CTX水平高于非骨质疏松组，而ALP低于非骨质疏松组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 两组β-CTX、ALP水平比较

2.3 miRNA-16和miRNA-92a对T2DM合并骨质疏松症的诊断效能 诊断T2DM合并骨质疏松症时，miRNA-16灵敏度为71.70%，特异度为55.26%；miRNA-92a灵敏度为69.35%，特异度为58.62%。见表5和图1。

表5 miRNA-16和miRNA-92a对T2DM合并骨质疏松症的诊断价值

图1 miRNA-16和miRNA-92a诊断2型糖尿病（T2DM）合并骨质疏松症的ROC曲线

2.4 miRNA-16、miRNA-92a与 β-CTX、ALP 的相关性 miRNA-16、miRNA-92a与 β-CTX均呈正相关（均 P＜0.05），而与 ALP均呈负相关（均P＜0.01）。见表6。

表6 miRNA-16、miRNA-92a与β-CTX、ALP的相关性

2.5 影响T2DM合并骨质疏松的独立危险因素 经多因素logistic回归分析显示，年龄＞60岁、miRNA-16和miRNA92表达均为影响T2DM合并骨质疏松的独立危险因素（均P＜0.05）。见表7。

表7 多因素logistic回归分析影响T2DM合并骨质疏松的独立危险因素

3 讨论

骨质疏松症是我国中老年人常见的一种疾病，其特征主要为骨干质量的改变、骨骼的退化，伴机械负荷能力减弱及骨骼硬度下降[5-6]。T2DM合并骨质疏松症者发生骨折概率较高，具有较高致残率和致死率，对患者生活质量造成严重影响[7-9]。

正常机体骨代谢处于吸收和形成相对动态平衡的一种状态，骨代谢标志物包括骨吸收与骨形成标志物两部分，因此检测骨代谢水平可有效、及时地反映骨吸收和骨形成的速率，实现对骨质疏松症的筛查和诊疗[9]。β-CTX是重要的一种骨吸收标志物，能够反应破骨细胞的状态，骨质疏松症患者骨吸收增强，会使破骨细胞活性上升，β-CTX水平随之升高[10]。ALP主要源自于成骨细胞，对骨形成和骨矿化均发挥重要作用，且是骨形成和骨转化的重要生化标志[11]。本文研究发现，T2DM合并骨质疏松组患者血清β-CTX高于非骨质疏松组，而ALP低于非骨质疏松组，提示T2DM合并骨质疏松症患者存在骨代谢异常。

miRNA具有19～22个核苷酸，主要通过降解靶mRNA调控生命过程的小分子RNA来参与增殖、分化及凋亡等生物过程。近年来，miRNA在骨质疏松症和退行性骨关节疾病的发生、发展中的影响研究成为热点[12-14]。研究发现，miRNA作为调节细胞凋亡过程的重要成员，其对关节软骨细胞和软骨基质的代谢及骨质疏松症的发生、发展具有一定的影响[15]。越来越多研究强调了miRNA在调节骨髓间充质干细胞、破骨细胞及成骨细胞的功能和分化方面的作用，且认为miRNA通过Wnt信号通路、转化生长因子-β及骨形态发生蛋白来促进间充质干细胞向成骨细胞分化以及骨形成，但因miRNA不能抵御核酸酶，且缺乏靶向性，故而以支架为基础的miRNA载体在难治性骨质疏松性骨折的骨修复中具有特殊的应用前景[16]。而目前临床上对miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨质疏松症中研究甚少，且尚无有关miRNA-16和miRNA-92a与骨代谢相关研究，缺乏可靠的参考依据，故而还需后续增加样本量，作多中心、多样本深入研究，提供可靠的临床参考价值。本研究发现，T2DM合并骨质疏松组血清miRNA-16和miRNA-92a相对表达量高于非骨质疏松组，由此可见T2DM合并骨质疏松症患者血清miRNA-16和miRNA-92a呈高表达。同时，本研究发现，T2DM合并骨质疏松症中，miRNA-16诊断灵敏度为71.70%，特异度为55.26%；miRNA-92a诊断灵敏度为69.35%，特异度为58.62%，由此可见血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨质疏松症中具有良好诊断价值；且miRNA-16和miRNA-92a与β-CTX呈线性正相关，而与ALP呈线性负相关。

综上所述，血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨质疏松症中高表达，且与骨代谢明显相关。