利用生物信息学技术探究动脉粥样硬化斑块破裂的关键基因

林少沂，朱云云，姚麒

1 资料与方法

1.1 数据来源 以“Atherosclerosis”为关键词在GEO数据库中检索与动脉粥样硬化斑块相关的基因表达谱数据。选择了GSE41571和GSE120521表达芯片，均检测颈动脉斑块mRNA表达谱，前者包括5个破裂斑块样品和6个稳定斑块样品，后者包括4个破裂斑块样品和4个稳定斑块样品。从GEO数据库下载矩阵文件和芯片探针注释文件。

1.2 方法 利用GE02R对GSE41571进行差异基因表达值计算，选取校正后P＜0.05及I logFC（fold change）l＞2作为筛选阈值，得到DEGs。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对共有差异表达基因进行基因本体论（GO）和信号通路（KEGG）富集分析。利用STRING10.5（https://stringdb.org）对共有差异表达基因编码蛋白的相互作用进行网络分析，设置最低要求的相互作用分数为0.9。利用Cytoscape_v3.8.2软件插件Cytohubba寻找蛋白相互作用网络中与不稳定斑块发生发展相关的核心模块和关键基因，并分析核心模块相关的生物学功能及关键基因表达与斑块稳定性的关系。

2 结果

2.1 差异表达基因 筛选96个DEGs，与稳定斑块相比，破裂斑块中有17个基因表达上调，79个基因表达下调（封三彩图6）。

2.2 差异基因富集分析 GO包括分子功能、生物过程和细胞组成三部分。GO和KEGG分析推测动脉粥样硬化斑块的稳定性可能与这些基因功能或信号通路的改变有关。表达下调的差异基因：功能主要富集在细胞黏附、细胞基质黏附、钙离子结合和钾离子跨膜转运等，通路主要富集在调节干细胞多能性的信号通路（表1）。表达上调的基因富集于免疫反应、血管内皮生长因子受体信号通路、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性及蛋白质结合等。

表1 差异基因的GO和KEGG分析

2.3 编码蛋白相互作用网络（CPPI）构建及分析 CPPI构建得到了由93个节点、30条连线构成的相互作用关系图。蛋白相互作用网络分析得到了由3个共表达基因构成的核心模块，均为下调的差异表达基因（封三彩图7）。MCC算法得到FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL 21A 1、FAP、LCP2、HECW2、GLIS2 10个关键基因。

这10个在差异表达基因编码蛋白相互作用网络中的关键节点基因。除LCP2基因外，其余9个关键基因均为下调基因且同时存在于前面分析的核心模块中。进一步检测GSE120521基因芯片中10个关键基因的表达，破裂斑块中FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL21A1、FAP、HECW2及GLIS2减少，而LCP2增加（封四彩图1～2）。

3 讨论

斑块稳定性对AS临床事件的发生至关重要，但其分子机制尚不清楚。本研究从GSE41571中筛选出96个DEGs，其中下调的79个DEGs功能主要富集在细胞黏附、细胞基质黏附、钙离子结合和钾离子跨膜转运等，通路主要富集于调节干细胞多能性的信号通路。上调的17个DEGs富集于免疫反应、血管内皮生长因子受体信号通路、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性及蛋白质结合等。

通过PPI与斑块稳定性相关的核心模块初步探索，最终确定了10个关键基因。破裂斑块中FZD7、ASPN、PAK3、STK38L、KIF3A、COL21A1、FAP、HECW2、GLIS2及LCP2的表达水平显著改变。除LCP2表达上调外，其余9个基因在破裂斑块中表达均降低。GSE120521上述10个关键基因的表达情况，与GSE41571一致。这些基因可能在斑块的稳定性中起关键作用。

FZD蛋白是具有7次跨膜结构的Wnt受体家族，FZD7是其中唯一可以激活Wnt通路每个分支（Wnt/-catenin途径、Wnt/PCP途径和Wnt/Ca2+途径）的成员[1]。FZD7参与调节肿瘤血管生成，敲除FZD7基因可以显著抑制肿瘤血管新生[2]。ASPN是一种细胞外基质蛋白，可通过抑制Toll样受体信号通路发挥抗炎作用[3]。PAK3属于P21活化的激酶家族，在细胞骨架重塑、细胞迁移、蛋白合成及细胞存活等生理过程中发挥重要作用[4]。STK38是NDR蛋白激酶家族的成员，进化上高度保守，其活化后参与细胞周期、增殖、凋亡与自噬等多种生命活动的调控，尤其在细胞周期中扮演着重要角色[5-7]。KIF3A是驱动蛋白2家族成员，除了拥有驱动蛋白的一些共性（调节细胞内运输，介导微管运动等）外，在增殖和迁移上亦有重要作用[8]。COL21A1编码XXI型胶原的 链，维持细胞外基质的完整性。FAP蛋白参与控制成纤维细胞生长。HECW2作为胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）/Ret信号的调节因子，在血管生成中发挥重要作用。GLIS2是转录因子，已知参与Hedgehog通路刺激转录反应，该信号通路控制细胞增殖与分化。

唯一上调的基因LCP2编码的蛋白是淋巴细胞胞浆蛋白2，作为T细胞抗原受体活化蛋白酪氨酸激酶途径底物的衔接蛋白，是多种受体下游信号级联的重要中间产物。LCP2调节免疫受体信号传导（如T细胞受体），也是中性粒细胞和血小板中整合素信号传导所必需的[9]，在介导白细胞黏附和激活中起重要作用[10]，提示斑块破溃与炎症和免疫密切相关。LCP2可能为预测动脉粥样硬化斑块破裂和治疗提供新的分子靶点。

本研究还存在一些局限性，样本量较少，同时也导致相关GEO数据集中缺乏临床特征数据，这些可能会影响某些亚组患者结果的准确性。