间充质干细胞调控炎性巨噬细胞极化的机制研究进展

赵吉玲，余国龙，彭漪，肖轶，彭智勇

(中南大学湘雅医院心血管内科，长沙 410008)

巨噬细胞在人体广泛存在，可塑性强、功能多样。原位巨噬细胞可由循环单核细胞转化形成，参与组织发育及稳态维持[1]。循环单核细胞在趋化因子及黏附分子作用下，从骨髓募集到炎症局灶组织并分化为巨噬细胞，通过促炎(M1)/抗炎(M2)表型转换，清除病原体及坏死组织，同时抑制过度损伤、保持组织完整性[2]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种从骨髓或其他组织(脐血、脂肪、皮肤、肌腱、肌肉和牙髓等)中分离、扩增并具有多向分化潜能的干/祖细胞，除可促进组织功能性再生修复外，还有广泛的免疫调节和抗纤维化活性[3]。研究证实，MSCs移植可显著增加心肌梗死区域M2型巨噬细胞的浸润，减少纤维化，增加血管生成，改善心功能，MSCs移植疗效并非通过心肌细胞再生，而是通过调控炎症反应，下调促炎因子[如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]的表达，上调抗炎因子[如白细胞介素(interleukin，IL)-10]的表达，避免过度炎症反应和炎症导致组织损伤[4-5]。Bernardo和Fibbe[6]总结、概括相关MSCs调节炎症的实验研究认为，MSCs移植已经显示出治疗炎症反应性疾病的临床应用潜能。现就MSCs对巨噬细胞介导的炎症调节效应及MSCs介导单核/巨噬细胞亚型转化机制及分子通路的研究进展予以综述，以期为干细胞治疗炎症性疾病或炎症性损伤相关疾病的进一步研究及临床应用提供参考。

1 MSCs对巨噬细胞介导的炎症调节效应

1.1炎症反应与M1/M2型巨噬细胞 组织巨噬细胞是参与组织微环境炎症反应的主要功能细胞，参与炎性损伤、抗炎和组织修复等多重作用[7]。巨噬细胞根据表面白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)及其效应分为两类亚型，即M1型和M2型[7]，M1型CD在人、小鼠和大鼠分别是CD14++CD16-、Ly6C++和CD80+，占外周血单核细胞总数的80%～90%。而M2型CD在人、小鼠和大鼠分别是CD14+CD16++、Ly6C+和CD163+。炎症区域巨噬细胞可因组织微环境变化转换为M1型或M2型，有研究显示，急性心肌梗死后1～4 d以M1型巨噬细胞浸润为主，心肌梗死后3 d达高峰，同时伴有IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子水平增高，M1型巨噬细胞通过细胞吞噬、蛋白酶溶解消化与清除坏死心肌组织，同时亦导致炎性心肌损伤[8]。急性心肌梗死后4～10 d M2型巨噬细胞逐渐替代M1型巨噬细胞浸润，炎症逐渐消退，5～7 d M2型巨噬细胞数量超过M1型，直至15 d左右，伴有IL-10、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1等抗炎因子水平增高，参与抗炎及促心脏修复效应。

1.2炎症区域MSCs双重效应 炎症区域MSCs与巨噬细胞同样可因组织微环境变化转换为M1型或M2型[9]。在高水平TNF-α和γ干扰素的环境下，MSCs分泌高水平的吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素E2、一氧化氮、TGF-β1，释放趋化因子(如CC趋化因子配体2、CC趋化因子配体3和CC趋化因子配体12)，表现为M2型，上调调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)水平。在低水平TNF-α和γ干扰素情况下，MSCs表现为M1型，分泌炎症因子(如IL-6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和巨噬细胞迁移抑制因子)增加，募集中性粒细胞并增强其促炎症活性，将淋巴细胞募集至炎症部位，增强免疫应答。MSCs表型转换与巨噬细胞相同，一方面M1型促进炎症反应，增加宿主防御，另一方面M2型抑制炎症反应，防止组织过度损伤。

1.3MSCs介导单核/巨噬细胞表型转化 体外MSCs和巨噬细胞共培养发现，M1型巨噬细胞产生的促炎因子激活MSCs，诱导M2型巨噬细胞、IL-10、TGF-β1等细胞因子释放，使单核细胞的分化倾向于抗炎特性，并最终导致M2型巨噬细胞极化[9]。反之，MSCs与巨噬细胞动态反馈调节，可调控巨噬细胞促炎和抗炎效应，以维持组织稳态并保持组织完整性。对人脐血MSCs静脉移植的心肌梗死小鼠模型的研究发现，治疗1周后，外周血、脾脏M1型单核细胞数量减少，M2型增加，M1/M2比值减小，心肌组织巨噬细胞M1、M2型数量及M1/M2比值亦发生相同变化，残存心肌细胞数量较多，单核淋巴细胞浸润明显减少，心肌细胞凋亡指数和心肌胶原沉积降低，血清细胞促炎因子IL-6和半乳凝素-3水平亦显著下降[5]。

前期初步研究[4]认为，MSCs介导单核/巨噬细胞表型转化机制依赖于其分泌的生物活性物质[如诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素E2、IL-10]，决定了M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞之间的转换。研究证实，MSCs还可通过Treg细胞及外泌体等途径介导单核/巨噬细胞表型的转化[4,10]，故MSCs及其分泌生物活性物质影响单核/巨噬细胞亚型分化机制尚未完全明确。

2 MSCs对巨噬细胞亚型转化机制及相关通路

多种生物活性物质[IL-10、一氧化氮、吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素E2、TGF-β1、TNF-α刺激基因6(tumor necrosis factor-α stimulated gene 6，TSG-6)、Treg细胞及外泌体等]均与MSCs介导的单核巨噬细胞亚型转化相关[4,10]。现主要阐述MSCs介导巨噬细胞亚型转化的以TGF-β1、TSG-6为主的细胞因子途径、Treg细胞途径及外泌体途径。

2.1细胞因子途径

2.1.1TGF-β1及其相关通路 TGF-β1是一类多功能生长因子，属于TGF-β超家族。TGF-β1与其配体受体结合后激活，促进或抑制细胞增殖，参与调节细胞迁移和分化，在维持组织稳态、诱导凋亡、影响细胞自我更新和分化状态的平衡等活动中起重要作用[11]。TGF-β1在MSCs介导M1/M2亚型转化及随后的组织修复和血管生成中发挥重要作用，TGF-β1促进巨噬细胞向M2型转化，若抑制TGF-β1活性，巨噬细胞则向M1型转化，导致促炎因子IL-1β、TNF-α分泌增加[11]。

TGF-β1典型信号转导途径由Smads(Smad proteins)介导[12]，TGF-β1与跨膜受体结合可活化转录因子Smad2/3并与Smad4结合，Smad2/3/4复合物易位到细胞核，激活Smads途径上调M2型基因[如精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)和半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特异性巨噬细胞凝集素2(macrophage lectin specific for galactose/N-acetyl galactosamine 2，MMGL2)]的表达，诱导M2型巨噬细胞极化；而γ干扰素和TNF-α可上调Smad7表达，Smad7阻止Smad2/3磷酸化，抑制TGF-β1/Smads通路，并激活促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/p38 MAPK通路及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路形成TGF-β1非Smad依赖性信号转导途径，从而诱导M1型巨噬细胞。其中MAPK家族在促炎介质和细胞因子表达中起关键作用，抑制MAPK活化选择性地促进神经小胶质细胞M2极化、减少炎症介质和细胞因子的产生，升高抗炎因子(IL-10及TGF-β)的水平[13]。

ERK包括ERK1和ERK2，磷酸化ERK1/2由胞质转位到核内，介导系列核因子转录活化，参与介导巨噬细胞亚型转化。如TGF-β1通过激活ERK信号调节肿瘤相关巨噬细胞转录因子，ERK活化可诱导巨噬细胞M1型转化。Su等[14]研究证明，在诱导巨噬细胞亚型转化实验中，加入ERK特异性抑制剂可降低M2型转化率及减少TGF-β1表达，在小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞株中ERK通路独立于Smads通路，参与TGF-β1诱导M2型巨噬细胞的极化。在人肾小球系膜细胞中发现，TGF-β1诱导Smads的磷酸化需要活化的ERK参与，ERK活化激活并调节Smads磷酸化，Smads信号通路反过来增强ERK基因转录[15]。故TGF-β1可通过ERK途径介导巨噬细胞亚型转化，但与经典Smads通路之间的关系尚未明确，有待进一步研究证实。

JNK信号转导途径可通过TGF-β1受体、G蛋白相关受体等激活。有研究证实了肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞(adipose tissue macrophage，ATM)中JNK途径在巨噬细胞亚型转换中的作用，JNK激活促炎基因表达，促进M1型巨噬细胞极化，肥胖小鼠ATM多表现为M1型，而非肥胖对照小鼠ATM多表现为M2型[16]，同时ATM-M1表型对胰岛素抵抗的发生有促进作用[7]。此外，JNK也可激活TGF-β1通路中M2型转录因子Smad3，而限制促炎巨噬细胞M1型形成，表明JNK可能参与巨噬细胞M2型的转化[17]。

p38是MAPK家族控制炎症反应的最重要成员，TGF-β1通过非Smads途径激活p38 MAPK，激活p38 MAPK信号通路导致小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞促炎M1型巨噬细胞表达；p38通路的关键酶——TGF-β激活酶可介导TGF-β1的信号转导，并可抑制p38 MAPK(分裂原激活蛋白激酶)介导的载脂蛋白的表达，抑制动脉粥样硬化斑块中的促炎M1型巨噬细胞的生成[18]。

TGF-β1以肿瘤坏死因子受体相关因子6活性依赖的方式磷酸化激活磷脂酰肌醇-3-激酶及Akt，形成磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt信号通路。Akt有3种亚型，其中Akt1增加M2表型基因(Arg-1和IL-4)的表达，促进M2型形成；Akt2则增加M1表型基因(iNOS和TNF-α)的表达，促进M1型形成；Akt3作用尚不明确[19]。翻译信号在Akt1和Akt2之间的切换可能是巨噬细胞具有高度可塑性的机制之一[20]。

2.1.2TSG-6及其相关通路 TSG-6是一种抗炎蛋白，在各种炎症或自身免疫性疾病患者多种细胞中高表达，TNF-α和IL-1等炎症细胞因子均可诱导其表达，其是影响MSCs免疫调节特性的关键因素[21]。TSG-6是心肌梗死及角膜损伤模型移植MSCs后上调最明显的蛋白质之一，局部移植MSCs角膜中的TSG-6表达增加，角膜上皮细胞增殖增多，炎症反应减弱，损伤角膜上皮愈合加快[22]；在烧伤及皮肤切口处，MSCs释放TSG-6，抑制M1型巨噬细胞活性、减少TNF-α释放，减少组织损伤和肉芽组织形成，调节TGF-β1/TGF-β3比例的抗纤维化，显著抑制组织纤维化，促进愈合及功能修复[23]。体外巨噬细胞间接共培养表明，MSCs通过以TSG-6依赖性方式抑制单核/巨噬细胞募集，减轻白细胞浸润，并促进募集巨噬细胞极化为抗炎M2型[24]，MSCs移植促进巨噬细胞极化的作用在很大程度上能够被TSG-6的干扰小RNA敲除消除[25]。但目前TSG-6介导MSCs促进巨噬细胞亚型转化的具体通路仍不明确，有实验证明，TSG-6可能通过抑制核因子κB信号通路的活化减少促炎因子的产生，启动抗炎因子的级联释放，减少促炎M1型巨噬细胞的活化；人骨髓MSCs与人髓系白血病单核细胞共培养实验证明，人骨髓MSCs分泌TSG-6是通过抑制MAPK中p38和ERK进而抑制促炎M1型巨噬细胞的活化，从而调控炎症反应[25]。

2.2Treg细胞途径 Treg细胞是重要的免疫抑制细胞，可抑制多种抗原(如自身抗原、共生细菌衍生抗原和环境过敏原)的过度免疫反应，避免过度炎症反应对组织的破坏，在控制炎症、自身免疫反应、肿瘤细胞生长方面有至关重要的作用[26]。Treg细胞不是炎症反应的主要功能细胞，但可在一定程度上影响疾病的发展。

在肝纤维化小鼠模型中，Treg细胞消耗没有改变纤维化肝脏中库普弗细胞的数量，但可选择性地增加M1型库普弗细胞分泌iNOS、IL-1β、IL-12，抑制M2型库普弗细胞分泌Arg-1、TGF-β、IL-10。Treg细胞通过影响库普弗细胞功能抑制局部微环境炎症反应，降低细胞毒性淋巴细胞的活性，进而调节库普弗细胞介导的炎症反应，减少过度炎症所致的缺血性肝损伤[27]。在MSCs干预的大鼠及小鼠哮喘模型中，淋巴、外周血和肺组织标本中的IL-10和Treg细胞水平均显著升高[28]。实验证明，MSCs分泌的TGF-β1介导了Treg细胞的活化，TGF-β1受体抑制剂可抑制MSCs诱导的Treg细胞的活性，TGF-β1缺陷小鼠外周Treg细胞的数量显著减少[29]，TGF-β1是Treg细胞分化过程的主要参与者，证实了Treg细胞诱导及发育的重要性：TGF-β1在T细胞中诱导叉头框转录因子P3，而叉头框转录因子P3能够决定Treg细胞的产生、分化和功能维持[30]。故MSCs调节免疫应答的机制之一是通过TGF-β1调控Treg细胞功能实现。

2.3外泌体途径 外泌体又称生物纳米粒子，直径通常为50～100 nm，是几乎所有细胞均可产生释放的一类携带各种蛋白质、脂质和核酸的细胞外囊泡，不同细胞类型或不同功能状态下细胞释放的外泌体各不相同。MSCs源外泌体在肺动脉高压小鼠模型、心肌缺血再灌注及大鼠心肌梗死模型中呈现出抗炎及心脏保护作用；多项研究显示，骨髓或脂肪组织MSCs分泌的外泌体具有抗炎、抗纤维化、抗凋亡及促血管生成作用，但具体机制仍不明确[31-32]。研究表明，外泌体可通过介导巨噬细胞亚型转化调控炎症反应及促进组织修复[33-34]。de Couto等[33]研究显示，冠状动脉内注射心脏祖细胞外泌体，可减少心肌梗死组织内CD68+M1型巨噬细胞的浸润数量，促进M2型巨噬细胞极化，使促炎基因(Nos2和TNF-α)的表达显著减少，抗炎基因(Arg-1、IL-4、TGF-β1和血管内皮生长因子)表达水平显著升高；同时，外泌体miR-181a下游信号通路蛋白还参与了巨噬细胞亚型转化。Xu等[34]研究发现，脂多糖预处理MSCs来源的外泌体可增强心肌梗死模型心肌组织中巨噬细胞M2极化效应，抑制心肌组织炎症和心肌细胞凋亡。Zhao等[35]研究显示，在心肌缺血再灌注模型中，MSCs来源的外泌体在体内和体外均将M1型巨噬细胞的极化修饰为M2型巨噬细胞；外泌体的miRNA测序表明，miR-182介导了巨噬细胞M2极化，miR-182抑制剂可减弱外泌体对巨噬细胞的M2极化效应。实验显示，对扩张性心肌小鼠模型静脉注射骨髓MSCs外泌体，外周血清炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α显著减少；循环Ly6Chi单核细胞(M1)减少，Ly6Clow单核细胞(M2)增多；心肌组织M1型巨噬细胞iNOS、CD32和CD11c表达减少，而M2型巨噬细胞Arg-1、半乳糖/N-乙酰-半乳糖胺特异性巨噬细胞凝集素-2和CD206表达显著增多；经典巨噬细胞极化信号通路Janus激酶蛋白及其下游信号转导及转录激活因子6蛋白表达增加，表明MSCs源外泌体是通过Janus激酶-信号转导及转录激活因子6分子信号通路途径介导单核/巨噬细胞向抗炎型M2转化[36]。采用人脐血MSCs源外泌体治疗烧伤大鼠皮肤创伤模型的实验发现，人脐血MSCs源外泌体可显著下调大鼠创伤皮肤巨噬细胞中Toll样受体4、核因子κB/P65和磷酸化P65蛋白表达，TNF-α和IL-1β水平降低，IL-10水平显著升高，证实人脐血MSCs源外泌体可通过Toll样受体4/核因子κB/P65途径诱导巨噬细胞表型变化，抑制炎症反应[37]。

3 小 结

巨噬细胞M1型向M2型的转化是炎症反应中炎性组织损伤向促组织修复转折的生物学标志，改善组织微环境炎症状态是所有干预措施产生组织保护作用的前提和基础[38]。综合上述研究，认为巨噬细胞表型高度可塑，MSCs可以旁分泌的多种方式调控炎症反应中巨噬细胞M1/M2型转化，进而实现对组织炎症反应的调节，从而进一步明确MSCs治疗炎症性疾病或炎症性损伤相关疾病的作用机制。在体内微环境中，MSCs及巨噬细胞亚型转化的机制及通路非常复杂，进一步探索MSCs在体内炎症微环境中调控巨噬细胞M1/M2型的转化途径与机制，对MSCs移植治疗炎症性疾病或炎症性损伤相关疾病的实验研究及临床应用具有重要意义。