冠心病细胞焦亡的分子机制及其新药靶点的研究进展

刘超，高嘉良，王阶

(1.中国中医科学院广安门医院心内科，北京 100053； 2.北京中医药大学，北京 100029)

冠心病是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率高、致死风险大，已成为全球重要的公共卫生问题[1]。冠状动脉粥样硬化是冠心病发生的基本病理表现，既往研究证实，炎症反应在斑块形成、破裂、血管堵塞所致急性心血管事件中起重要作用[2-3]。细胞焦亡是由多种病原体或非感染因素刺激产生的一种固有免疫反应，是依赖胱天蛋白酶(caspase)1、4、5、11、炎症小体以及GSDMD(Gasdermin D)蛋白的一种伴有炎症反应的程序性细胞死亡模式[4-5]。细胞焦亡一词最早来自希腊语“Pyroptosis”“pyro”意为“火”“ptosis”表示“下降”，pyroptosis表示细胞焦亡[6]。与细胞凋亡和细胞坏死不同，细胞焦亡既能表现出与细胞凋亡相似的细胞核皱缩、外吐小泡、DNA断裂、Annexin V及原位末端转移酶标记法染色阳性[7]，又能表现出与细胞坏死类似的细胞肿胀破裂、炎症内容物释放的特征[8]。细胞焦亡在炎症反应中占据重要地位，并在冠心病相关炎症反应中发挥重要作用[9-10]。部分研究证实，细胞焦亡会导致冠心病患者血液中炎症因子的高表达[11-12]，并加速动脉粥样硬化进展[13]；抑制细胞焦亡途径的各个环节可有效抑制炎症因子的释放，延缓动脉粥样硬化进展[14]，缩小心肌梗死面积，改善心功能[15]；同时针对冠心病细胞焦亡中的各靶点，相应特异性抑制剂的研发也已取得一定成果[16]。现就细胞焦亡在冠心病中的作用机制以及作为药物靶点的研究进展进行综述。

1 细胞焦亡相关信号通路

1.1经典信号通路 经典的细胞焦亡信号通路是依赖caspase-1介导的信号通路[17]。细胞通过病原体相关分子模式和损伤相关分子模式识别危险信号，激活细胞质内的模式识别受体[18]。模式识别受体被激活后，其热蛋白结构域可以募集细胞质中的凋亡相关斑点样蛋白，并与之结合，从而形成一个多蛋白复合物炎症小体[19-21]。激活后的凋亡相关斑点样蛋白结构域可以募集caspase-1前体，并将其水解成具有活性的caspase-1[8]，活化的caspase-1一方面可以切割GSDMD，使其N端结构(GSDMD-NT)暴露，进而特异性地与细胞膜内侧的磷酸酰肌醇磷酸盐、磷脂酰丝氨酸以及细胞膜内外侧的心磷脂结合[22]，进而在细胞膜上打孔，使细胞膜表面形成10～14 nm蜂窝状的孔洞结构，改变细胞通透性，造成细胞肿胀破裂，发生焦亡[17]。另一方面，caspase-1还可以切割未成熟的白细胞介素(interleukin，IL)-1β前体和IL-18前体，从而形成IL-1β和IL-18，当细胞焦亡发生时，两种炎症因子大量释放，促进炎症级联反应的发生[22-23]。经典细胞焦亡信号通路的研究较为深入，是目前炎症疾病研究的热点。

1.2非经典信号通路 非经典的细胞焦亡信号通路由人源caspase-4、5和鼠源caspase-11所介导[24-25]。与复杂的经典通路不同，革兰阴性菌的内毒素脂多糖可直接激活caspase-4、5、11，进而切割GSDMD，使其N端结构域暴露，诱发GSDMD-NT在细胞膜上打孔，导致细胞通透性改变，进而发生细胞焦亡[26]。同时，激活的caspase-4、5、11也可以活化核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)3炎症小体，进而激活经典的焦亡信号通路[27]。活化的caspase-4、5、11可以激活细胞膜表面控制小分子物质进出的Pannexin-1通道释放ATP，进而激活细胞膜表面对ATP敏感的嘌呤能离子通道型受体7，导致细胞膜表面形成小孔，诱导焦亡发生[28]。此外，激活的Pannexin-1通道还可通过释放K+激活NLRP3炎症小体，活化caspase-1，从而激活经典的细胞焦亡通路[29]。目前对细胞焦亡非经典信号通路的研究尚不全面，其与经典信号通路之间的联系还有待深入研究。

1.3信号通路关键蛋白 GSDMD是Gasdermin蛋白家族中的一种重要蛋白，具有Gasdermin结构域，是所有caspase的共同底物，其能够在细胞膜上形成孔洞结构，促进细胞焦亡发生，是细胞焦亡经典途径和非经典途径发生的最后执行蛋白[26,30]。人源GSDMD由487个氨基酸和2个结构域[N端(Gasdermin-NT)和C端(Gasdermin-CT)]组成[31]。正常状态下，两个结构域相互结合，处于无活性的抑制状态，caspace活化后可特异性地切割GSDMD中两个结构域的连接区，进而暴露N端结构域，从而使其可以特异性地识别细胞膜上的磷脂类分子，并在细胞膜表面打孔，导致细胞渗透压改变，细胞肿胀破裂，引发细胞焦亡[32]。当敲除GSDMD基因时可阻止细胞释放IL-1β以及炎症小体和脂多糖引发的细胞焦亡，证实了GSDMD在细胞焦亡中的关键作用[33]。此外，Gasdermin蛋白家族中的另一种蛋白GSDME(Gasdermin E)可被caspase-3切割，暴露GSDME的N端结构域，与GSDMD-NT类似，GSDME-NT可特异性地与细胞膜表面脂质体结合，在细胞膜表面形成孔洞结构，诱发细胞焦亡[34-35]。多年来caspase-3一直被认为是诱发细胞凋亡的关键因子，而其对GSDME的特异性切割、诱发细胞焦亡的现象建立起细胞凋亡向细胞焦亡转变的新途径[36]。

2 冠心病细胞焦亡过程与新药作用靶点

2.1炎症小体 炎症小体是固有免疫反应的重要组成部分，是调控细胞焦亡的关键环节。目前发现参与细胞焦亡的炎症小体主要有NLRP3、NLRP1、NLRC4(NLR family,CARD domain containing 4)、黑素瘤缺失基因2炎症小体、Pyrin[37]，其中NLRP3研究最多，在冠心病的发生、发展中占重要地位[38]。研究发现，急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)和急性心肌梗死患者外周血中存在NLRP3的高表达，且NLRP3水平会随冠状动脉病变以及分叉病变数量的增加而升高[12,39-40]。NLRP3会增加冠状动脉壁中IL-1β的积累，并提高caspase-1的活性，导致冠状动脉内侧壁增厚，加速冠状动脉粥样硬化的进展，故NLRP3很可能成为预测冠心病的潜在生物标志物[41]。研究发现，与野生型小鼠相比，敲除NLRP3基因小鼠的心功能改善更明显，缺氧损伤较轻，并认为NLRP3可能是导致心肌缺血再灌注期间心肌梗死面积增加的重要因素[42]。

自噬是抗炎的重要环节，能够抑制NLRP3所介导的炎症反应，通过激活心肌细胞的自噬途径增加微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ的水平，降低p62的表达水平，抑制NLRP3形成，减少心肌缺血再灌注损伤[43]。针对NLRP3的特异性抑制剂已有动物和细胞研究证实，OLT1177[44]、MCC950[45]、Calpain[46]和黄芩苷[47]等可有效抑制NLRP3/ASC/caspase-1轴的激活，下调IL-1β、IL-18的表达，抑制早期炎症反应，减轻心肌损害，改善心功能。可见NLRP3不仅有潜力成为冠心病的特异性生物标志物，也可能成为冠心病治疗的重要靶点。

目前，针对其他炎症小体的研究相对较少。有研究发现，NLRC4在ACS患者中存在遗传变异，而这种变异会导致血清IL-18的高表达和caspase-1前体的激活，进而诱发细胞焦亡[48]。此外，NLRP1炎症小体介导的心肌缺血再灌注损伤也可由内质网应激通过核因子κB信号通路激活[49]。冠心病患者Pyrin等位基因M694V高表达，增加了其罹患急性心肌梗死的风险[50]。然而并不是所有的NLRC4都会促进细胞焦亡的发生，如线粒体中的NLRX1(NLR family member X1)在急性心肌梗死组织和缺氧诱导的H9C2细胞中显著减少，并通过抑制线粒体抗病毒信号蛋白、NLRP3和caspase-1的表达，减少细胞焦亡，起到保护心肌细胞的作用[51]。

2.2caspase家族 caspase家族主要参与细胞程序性死亡，其中caspase-1、4、5、11调控细胞焦亡[5]，caspase-3、6、7、8、9、10则是细胞凋亡的执行者[52]。参与细胞焦亡的caspase不仅能促进IL-1β、IL-18成熟，还能切割GSDMD，诱导细胞焦亡发生，特别是经典途径中caspase-1在冠心病中的研究较为深入。研究发现，冠心病患者主动脉caspase-1水平显著升高，并与冠状动脉Gensini评分、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和脂蛋白α呈显著正相关(P<0.05)，与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关(P<0.05)，故认为caspase-1有可能成为防治冠心病的潜在靶点[53]。此外，抑制caspase-1的表达可在上游环节调控炎症因子的释放，有效减轻心肌缺血再灌注损伤[54]。进一步敲除caspase-1基因，可显著降低心肌缺血再灌注损伤小鼠血浆中基质金属蛋白酶3的活性和减少IL-18的表达，提高心肌梗死区周围心肌的存活率，降低心室扩张率，改善心功能[55]。仅有少数研究开展了针对非经典途径中caspase的研究，心肌缺血再灌注损伤可导致caspase-11升高，可通过调节p38促分裂原活化的蛋白激酶途径抑制caspase-11活化、保护心肌细胞[56-57]。

VX765是caspase-1的特异性抑制剂，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤[58]。而另一种特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk能显著抑制caspase-1的活性，减轻高胆固醇血症对心肌缺血再灌注损伤的不利影响[59]。秋水仙碱可显著减少ACS患者casapase-1信使RNA和蛋白的表达，降低IL-1β水平，抑制炎症反应，改善心功能[60]。另外，盾叶冠心宁片[15]和α-1-抗胰蛋白酶[61]可通过腺苷酸激活蛋白激酶途径抑制caspase-1的活性，减少IL-1β的释放，保护存活心肌，缩小心肌梗死面积，延缓心室重构的发生。caspase-1是冠心病细胞焦亡发生的关键调控因子，特异性抑制可能成为冠心病治疗的新途径。

2.3IL-1β和IL-18 IL-1β和IL-18是重要的致炎因子，会导致局部剧烈的炎症反应[62]。既往研究已经证实，冠状动脉粥样硬化斑块的形成与炎症反应密不可分[63]，而细胞焦亡释放的炎症因子IL-1β和IL-18会造成局部的炎症级联反应，在冠心病的发生中起重要作用。研究发现，在发生急性血管事件后，ACS患者心脏局部炎症因子IL-1β和IL-18的水平显著升高[64]，且这种高水平状态会持续6个月；多元回归分析显示，IL-1β水平与低密度脂蛋白胆固醇以及IL-18水平呈正相关，与高密度脂蛋白胆固醇水平呈负相关[65]，而IL-18的基线水平可直接反映患者的预后状况[66]。一项荟萃分析显示，IL-18rs187238和IL-18rs1946518是心血管疾病的易感基因，其表达会增加人群罹患冠心病的风险[67]。IL-1β和IL-18水平升高是患者发生急性心血管事件的特征表现之一，为了抑制此炎症反应的发生，正在研发相应药物。

卡纳单抗是炎症因子IL-1β的单克隆抗体。在一项涉及40个国家10 061例心肌梗死患者的多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验中，特异性IL-1β单抗卡纳单抗可以显著降低心肌梗死患者心血管不良事件的发生率(HR=0.75，95%CI0.66～0.85，P<0.000 1)[16]。此外，IL-1β能够诱导可溶性生长刺激表达基因2蛋白的表达，加速急性心肌梗死后的心力衰竭，而依普利酮能够拮抗这一效应，提高左心功能[68]。另外，中药川芎提取物可通过调节Toll样受体4/核因子κB信号通路抑制心肌IL-1β的表达，提高射血分数，缩小心肌梗死面积[69]。IL-18可加重心肌梗死后的心功能障碍，灯盏花素可通过降低体内IL-18和细胞间黏附分子-1的水平，减轻炎症反应，降低IL-18对心肌梗死后左心室重构的不良影响，达到延缓冠心病进展的目的[70-71]。综上可知，IL-1β和IL-18是冠心病细胞焦亡发生炎症反应的重要途径，是抑制冠心病炎症反应的重要靶点。

2.4GSDMD GSDMD是细胞焦亡过程中caspase-1、4、5、11的共同底物，其GSDMD-NT在细胞膜表面可发挥打孔作用，直接诱导细胞焦亡发生和炎症因子IL-1β、IL-18释放，是细胞焦亡发生最关键的蛋白质。GSDMD基因敲除会显著减少焦亡相关炎症因子的释放[72]。因此有学者主张将细胞焦亡定义为由GSDMD介导的细胞程序性死亡[30,33]。GSDMD在多种缺血性疾病的细胞焦亡中起重要作用[31,73]，并与冠心病密切相关，但对GSDMD的研究较少。临床研究发现，急性心肌梗死会导致焦亡相关蛋白GSDMD和GSDMD-NT水平升高，进而诱发巨噬细胞的细胞焦亡和下游的炎症反应[74]，而新型蒽醌类化合物琥珀酸Kanglexin能够阻止这一有害改变，并预防心脏损害和心功能不全[75]。动物研究发现，心肌缺血再灌注损伤会导致心肌细胞GSDMD-NT水平升高，大黄素可通过Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子κB/NLRP3途径抑制NLRP3介导的细胞焦亡，提高心肌细胞存活率，缩小心肌梗死面积，预防心室重构[76-77]。

动脉粥样硬化是冠心病的基本病理表现，延缓斑块进展是治疗冠心病的关键。高脂饮食会导致体内GSDMD-NT升高，其含量同氧化低密度脂蛋白水平呈浓度依赖关系[78]。降脂药阿托伐他汀可通过长链非编码RNA NEXN-AS1/NEXN途径降低GSDMD、IL-1β和IL-18的水平，从而抑制细胞焦亡，起到抗动脉粥样硬化的作用[14]。此外，红景天苷能够抑制GSDMD的表达，减少IL-1β释放，降低细胞焦亡导致的炎症级联反应，达到抗炎、延缓斑块进展的目的[79]。目前虽没有针对GSDMD的特异性抑制剂，但GSDMD作为细胞焦亡发生的共同底物，在治疗中展现出广阔的应用前景。

3 小 结

细胞焦亡在冠心病炎症反应中占重要地位，能够加速动脉粥样硬化的进展，从细胞焦亡途径研究冠心病的发病机制及新药作用靶点有广泛的应用前景。然而，目前细胞焦亡的机制尚不清楚，如缺乏对细胞焦亡非经典途径的深入研究，经典途径与非经典是否存在联系，细胞焦亡与细胞凋亡、细胞自噬之间是否存在拮抗关系，打孔蛋白GSDMD的核心机制等均不明确。同时，临床患者的病情往往较复杂，而现有冠心病细胞焦亡动物模型多采用缺血再灌注损伤模型，该模型能否真实反映临床实际情况还有待商榷。此外，针对细胞焦亡靶点中特异性抑制剂或基因敲除技术的研究还相对较少，无法明确各靶点在冠心病发生中的地位和作用。中医药具有多环节、多途径、多靶点作用的特点，而目前针对中药单体及提取物的研究仅局限于某一特定靶点，从多靶点、多环节抑制细胞焦亡还有待研究。因此，未来应深入探讨冠心病细胞焦亡的发病机制，并针对细胞焦亡的各环节、各靶点研制新的特异性抑制剂，并进行多中心、大样本随机对照试验，以期为冠心病的防治提供新策略。