骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤应用方法的多样性

刘明昊，于才勇，刘玲，王曦

(空军军医大学基础医学院，a.学员一大队，b.神经生物学教研室暨脑科学协同创新中心，西安 710032)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一类因创伤、肿瘤、缺氧、炎症等因素造成的脊髓完整性和连续性被破坏的疾病。近年来，SCI患者呈逐年增多趋势，且以青壮年居多。中枢神经系统神经元损伤后难以再生，造成SCI患者肢体和内脏功能恢复困难，给患者造成极大痛苦，同时也给患者的家庭和社会带来沉重的经济负担。自骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)被发现以来，其在中枢神经系统疾病中的作用一直是学者们研究的热点。移植BMSCs对于SCI患者具有显著的治疗作用，可改善SCI患者的预后，其内在机制可能由于BMSCs具有显著的神经营养、调节免疫平衡、抗氧化应激和抗凋亡等作用；在体外培养条件下BMSCs还具有跨胚层分化的能力，可提高突触传递功能，促进神经网络构建，改善后肢运动功能；此外，BMSCs可自身获得，因此可以有效避免免疫排斥反应[1-2]。这些特性使BMSCs成为治疗SCI的理想候选细胞。BMSCs治疗SCI有多种不同的应用方法，通过不同的机制发挥作用，产生不同的治疗效果。现就BMSCs治疗SCI的应用方法的多样性予以综述。

1 BMSCs概述

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类源于中胚层且具有自我更新和多项分化潜能的多能干细胞，其中BMSCs最早被发现，而骨髓也被认为是MSCs临床应用的主要来源之一[3]。1970年，Friedenstein等[4]首次发现来自骨髓的某种细胞可以在塑胶培养基上形成集落；1991年，Caplan[5]将这种细胞命名为BMSCs，同时发现BMSCs具有分化形成骨、软骨和脂肪的潜能。目前，国际细胞治疗协会建议通过以下标准识别BMSCs：可以黏附在塑胶上；在标准的体外分化条件下可分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞；可表达细胞表面标志物CD105、CD73和CD90，且不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19以及人类白细胞抗原DR等[6]。

2 BMSCs治疗SCI的多种应用方法及其作用机制

BMSCs可以跨胚层分化为属于外胚层来源的神经干细胞、神经元和胶质细胞[7]，并具有免疫调节、抗氧化应激和抗凋亡等作用，因此在减轻SCI后的继发性损伤方面具有广阔的应用前景，是一种被广泛研究的成体干细胞[8]。目前BMSCs治疗SCI具有多种应用方法，主要包括：直接移植体外培养扩增的BMSCs、仅应用BMSCs分泌的活性物质治疗SCI、体外诱导分化BMSCs为神经干细胞或前体细胞后再移植、用特定基因干预BMSCs后再移植以及BMSCs移植联合其他方法治疗SCI等。

2.1直接移植体外培养扩增的BMSCs 目前可以通过多种途径直接移植BMSCs治疗SCI，主要包括将BMSCs直接注射到损伤脊髓局部、鞘内注射、静脉注射或腹腔注射[9-10]。BMSCs具有“归巢”的特性，移植后会向损伤位点迁移[1]。移植体外培养扩增的BMSCs后，脊髓局部的表现和功能会显著改善，炎症反应缓解，细胞凋亡减轻[11]；出血反应与瘢痕纤维化减轻[12]；血脊髓屏障的完整性得到巩固[13]；轴突再生和再髓鞘形成能力提高，神经通路的重新构建增强[14]。在这种情况下，BMSCs发挥治疗作用主要通过神经营养、调控免疫平衡以及抑制氧化应激反应和神经元凋亡等机制。BMSCs可以通过分泌生长因子和神经营养因子(neurotrophin，NT)起到神经营养的作用，促进神经元再生[15-18]。SCI后，过度的炎症反应是引起继发性SCI的重要原因之一，调控免疫平衡、抑制过度的促炎症反应以及增强有利于愈合和再生的因子的合成和释放，是治疗SCI的重要策略之一，而移植BMSCs能够发挥这种作用[19-20]。氧化应激反应是引起SCI后继发性损伤的另一重要因素，如何抑制氧化应激反应也是治疗SCI的重要策略之一，而BMSCs可以通过抑制氧化应激，减轻继发性损伤，达到治疗的目的[21]。SCI后，一系列引起继发性损伤的因素均会导致残存的神经元凋亡，进一步加重损伤，而移植的BMSCs可以通过多种途径抑制神经元凋亡[22-24]，促进SCI大鼠的功能恢复。学者们陆续开展了多项临床试验，初步结果显示移植BMSCs后患者的运动、感觉以及膀胱功能改善，表明移植BMSCs安全可行，且能提高SCI患者的生活质量[1-2,9,25]。

2.2应用BMSCs分泌的活性物质治疗SCI SCI后，损伤区的微环境不利于移植细胞的存活，且移植细胞在体内的存活和分化方向难以控制，阻碍了移植细胞作用的发挥。直接利用BMSCs分泌的活性物质治疗SCI，可避免这些不利因素。BMSCs可以分泌众多有利于组织修复和再生的物质，包括多种营养因子、免疫调节因子、含有生物活性分子的外泌体等[1]。研究发现，给大鼠注射BMSCs的条件性培养液，可以显著减轻SCI，促进SCI后的功能恢复[26-29]，说明BMSCs条件性培养液中含有BMSCs分泌的促进脊髓再生和修复的物质。实验证实，条件性培养液可以减轻凋亡和氧化应激反应[30]。进一步检测发现，条件性培养液中至少含有120种蛋白质分子，包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管内皮生长因子、血管紧张素、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、睫状生长因子、白细胞介素-10以及白细胞介素受体拮抗剂等众多促进神经再生和组织修复的分子[31]。蛋白质组学证实，条件性培养液中含有丰富的神经营养、血管生成和免疫调节相关的蛋白分子[32]。近年研究还发现，静脉注射BMSCs分泌的外泌体也可以促进SCI后的功能修复[33]。BMSCs来源的外泌体可以通过抑制A1型星形胶质细胞活化[34]或作用于M2型巨噬细胞发挥作用[35]，促进损伤脊髓环境中星形胶质细胞和巨噬细胞向有利于再生和修复的表型转化。

2.3体外诱导BMSCs分化为神经前体细胞后再移植 虽然神经干/前体细胞是治疗神经系统疾病的一种良好的候选细胞，但伦理、法律和来源的制约限制了神经干/前体细胞的应用。而BMSCs可以由自身获得，避免了免疫排斥反应和伦理、法规的制约，因此很多研究通过BMSCs跨胚层分化来获取神经干/前体细胞，然后再移植治疗不同的中枢神经系统疾病。

多种因素可以促进BMSCs向神经干/前体细胞的跨胚层分化。BDNF、神经生长因子、GDNF、FGF-2等多种生长因子可以促进BMSCs向神经元或神经前体细胞分化[36-37]。声波、电刺激、抗氧化剂等多种方法也可以诱导BMSCs的跨胚层分化[38-40]。不同类型的RNA[如长链非编码RNA[41]和微RNA(microRNA，miRNA)[42]]也被证实在BMSCs向神经元分化过程中发挥重要作用。还有研究发现，SCI患者和多发性硬化患者血液中的自身反应性T细胞均可在体外诱导BMSCs跨胚层分化[43]。

BMSCs可以跨胚层分化为多种神经细胞，如多巴胺能神经元[44]、运动神经元样细胞[45]、少突胶质细胞样细胞[46]、5-羟色胺能神经元[47]、神经前体细胞[37]、神经元样细胞与胶质样细胞[48]等，体现出通过细胞替代方法治疗帕金森病、运动神经元疾病、脱髓鞘疾病、5-羟色胺失调的精神失常性疾病、SCI等疾病的应用前景。Ye等[49]用脑脊液诱导BMSCs分化为星形胶质细胞和神经元样细胞，并将其移植到大鼠损伤的脊髓，结果发现，BDNF、神经生长因子及神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的含量均增加，功能恢复也得到显著改善。de la Garza-Castro等[50]研究发现，与直接移植BMSCs相比，将BMSCs转化为施万细胞前体细胞后再移植治疗的SCI大鼠活动能力和被移植细胞的迁移率均进一步提高。由此可见，与移植脑和脊髓来源的神经干/前体细胞相比，BMSCs跨胚层分化获取的神经干/前体细胞避免了伦理、法规与来源的约束，而与直接移植BMSCs相比，移植BMSCs跨胚层分化获取的神经干/前体细胞对SCI患者的治疗针对性更强，具有一定的临床意义。

2.4基因干预BMSCs后再移植 将某些有利于神经再生的基因转染至BMSCs后再移植到SCI患者体内，对于SCI后的功能恢复具有更好的疗效。如将分别转染了音猬因子[51]、碱性FGF[52]、血管内皮生长因子[53]、GDNF[54]、miR-124[55]、Bcl-2[56]或miR-200a[57]基因的BMSCs移植到SCI大鼠，均有效促进了BMSCs的存活，增加神经纤维的再生和轴突生长，促进了运动和感觉功能的恢复；此外，miR-544[58]、miR-29b[59]或miR-126[60]基因修饰的BMSCs释放的外泌体亦更加有效地促进了SCI大鼠的轴突再生和运动功能的恢复。这些研究均提示，BMSCs经过基因干预后再移植，在治疗SCI方面具有良好的应用前景。

2.5BMSCs移植联合其他方法治疗SCI

2.5.1BMSCs移植联合应用生长因子 生长因子是通过与特异性细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他功能效应的多肽类物质。研究证实，将生长因子与BMSCs移植联合治疗SCI是一种有效的治疗方法[2]。Shin等[61]将FGF-2与BMSCs移植联合应用，发现FGF-2对移植的BMSCs具有增殖、保护和神经诱导作用，可提高BMSCs移植后的存活率，并显著改善了SCI症状。黄兴锐等[62]将碱性FGF与BMSCs联合应用后发现，胶质纤维酸性蛋白的表达减少，神经丝蛋白200的表达上调，残余轴突受到保护，促进了修复与再生，大鼠的运动功能也得到有效改善。表明FGF-2与BMSCs移植联合应用，一方面可以促进移植的BMSCs存活，另一方面通过叠加或协同发挥治疗作用，是一种有效的治疗策略。

2.5.2BMSCs移植联合电针刺激 电针疗法是指在针刺入人体穴位后，在针上通以接近人体生物电的微量低频脉冲电流进行刺激来防治疾病的一种疗法，与BMSCs移植联合应用，可以促进SCI后的功能恢复。王文峰和叶红晖[63]研究发现，电针联合BMSCs移植可促进BMSCs存活以及向神经元样细胞分化。Ding等[64]通过移植经酪氨酸激酶C基因修饰的BMSCs并联合电针疗法治疗SCI，结果发现其可通过提高脊髓NT-3水平，上调神经源性因子层粘连蛋白和生长相关蛋白-43的表达，下调胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖的表达，增加皮质运动诱发电位的传导，提高后肢运动功能。Liu等[65]还发现，联合电针疗法治疗可以促进移植的BMSCs分化为少突胶质细胞样细胞，促进轴突再髓鞘化。虽然电针本身的作用机制仍有待进一步研究，但BMSCs联合电针治疗SCI的效果肯定，电针刺激有可能改善了BMSCs发挥作用的微环境，因此也是一种应用前景广泛的治疗策略。

2.5.3BMSCs联合其他细胞移植 研究已经证实，单独移植神经干/前体细胞、少突前体细胞或嗅鞘细胞等可以提高SCI后的功能恢复[66-68]，而与BMSCs联合移植，将进一步提高SCI的治疗效果。脊髓脱髓鞘是SCI中常见的一种病理改变，Kaka等[69]将BMSCs转分化的少突前体细胞与未分化的BMSCs联合移植到损伤的大鼠脊髓，结果显示，脊髓空洞化程度降低，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分显著提高。Wu等[70]将嗅鞘细胞与BMSCs联合移植到损伤的大鼠脊髓，发现神经修复效果与抗凋亡作用较单纯的嗅鞘细胞或BMSCs移植更显著。Stewart等[71]应用过表达基质细胞衍生因子-1的BMSCs与神经干细胞联合移植治疗SCI大鼠，发现通过BMSCs过表达产生的基质细胞衍生因子-1作用于神经干细胞，更有利于轴突再生和运动功能恢复。这些研究提示，BMSCs与其他细胞联合移植可通过功能互补和协同作用促进SCI后的修复。

2.5.4BMSCs联合组织工程支架移植 在SCI的治疗过程中，脊髓空洞和胶质瘢痕形成的物理屏障限制了移植的BMSCs发挥作用，而组织工程支架可以在一定程度上克服物理屏障，为BMSCs提供良好的增殖、分化与迁移环境，使BMSCs发挥更好的效果。将BMSCs作为种子细胞，与生物性可降解支架相结合，在SCI的治疗中有巨大的应用前景。Zeng等[72]将高表达NT-3的施万细胞与高表达NT-3受体酪氨酸激酶C的BMSCs在三维明胶海绵支架中共培养14 d，结果支架中产生了神经网络，全细胞膜片钳记录到自发性突触后电流；将支架与细胞一起移植到大鼠脊髓横断间隙8周后，大鼠后肢功能和皮质运动诱发电位均得到改善。Kim等[73]将BMSCs与壳聚糖支架或体外聚乳酸-糖基乙酸支架联合移植，结果显示其细胞移植成功率较单纯BMSCs移植高，并具有较好的神经保护作用，运动功能改善显著。Chen等[74]将具有微通道和H型腔的管状支架与BMSCs共同移植治疗SCI，结果发现其促进了神经再生，抑制了神经元凋亡。Wang等[75]将BMSCs植入无细胞脊髓支架治疗SCI大鼠，结果证明其可以恢复受损脊髓的功能；且使用具有无细胞脊髓支架的BMSCs可减少损伤部位的巨噬细胞，通过早期调控炎症细胞募集，抑制凋亡和继发性炎症，促进功能恢复。以上研究表明，联合应用生物支架有利于移植的BMSCs存活、克服物理屏障、调节免疫微环境、抑制神经元凋亡、促进SCI部位神经元再生以及功能性突触的形成，同时促进神经网络的构建，对SCI损伤后的神经网络重建和功能恢复具有重要作用。

3 小 结

BMSCs是目前治疗SCI理想的候选细胞。BMSCs治疗SCI的应用方法具有多样性，可以直接移植使用或使用其分泌产物，也可以体外跨胚层分化为神经干/前体细胞后再移植，还可以经过基因修饰后再移植，或联合其他方法治疗SCI。目前还应进一步研究如何在SCI后复杂的微环境中提高移植细胞的存活率以及调控移植细胞的分化命运，并对比不同应用方法的优势和特点，针对不同SCI患者情况找到更加有效的应用方式，使BMSCs发挥最佳的治疗效果。相信未来BMSCs可以安全、有效地应用到SCI的临床治疗中，为不同SCI患者的康复提供有效的个性化治疗策略。