基于微流控芯片的血脑屏障体外模型构建

袁皓月，靳娅茹，庞 龙，徐 浩

（西安医学院临床医学院1，药学院2，基础医学部3，陕西 西安 710021）

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是由脑血管内皮细胞（brain microvessel endothelia cells，BMECs）和血管周围细胞形成的物理和功能屏障。BBB 对分子从血液到脑组织的运输具有高度的选择性，对于维持大脑的正常功能稳态至关重要，但也为药物进入脑组织产生治疗作用带来了困难[1]。因此，为了深入了解血脑屏障的结构和功能，了解化合物通过BBB 的渗透性，需要建立合适的BBB 体外模型[2，3]。作为被广泛使用的Transwell 方法和动物模型两种，其中Transwell 虽然在很大程度上可以解决目前BBB 体外研究的一些问题，但是Transwell 无法模拟流体剪切力等人脑生理特点[4]。动物模型耗时长、价格高，且与人类存在种属差异[5]。微流控芯片的发展为人体器官的体外模拟提供了新的方式。微流控芯片可以构建各种微结构，实现多种细胞的精确控制；采用注射泵控制微通道中流体的流动可以模拟人体内血流产生的剪切应力，这种剪切力可以诱导BMECs 的分化并可及时清除细胞代谢产物，为细胞生长提供一种与人体高度近似的环境[6]。本文基于微流控芯片的BBB 体外模型按常规的微管道结构分为平面型和垂直型两种，讨论两种体外模型的设计构建及其在炎症反应、药物筛选与递送等领域的具体应用。旨在为BBB 体外模型研究提供新的工具选择和思路。

1 血脑屏障的构成和功能

1.1 BBB 的构成 BBB 介于血液与脑组织之间，由BMECs、基底膜、周细胞、神经胶质细胞等构成。BMECs 与神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、周细胞之间相互作用形成一个动态的功能单元，称为神经血管单元，BBB 的形成和功能依赖于神经血管单元内密切的细胞间相互作用[7]。其中，BMECs 之间可以形成一种物理屏障阻碍物质通过相邻细胞之间的旁通道运输[8，9]；星形胶质细胞作为信号传导的中介诱导BMECs 发挥屏障特性，并且为神经元提供营养物质，清除其代谢产物[10]；还有相关研究证实，星形胶质细胞的Ca2+信号可以参与血管直径的调节[11]；周细胞可以嵌入微血管基底膜内并包裹内皮细胞[12]，通过旁分泌的方式释放信号分子，这些信号分子作用于BMECs 参与调控血管的形成[13]。血管壁的组织发生，包括BMECs 与周细胞的联系，需要星形胶质细胞的参与[14]。

1.2 BBB 的功能 BBB 严格调控分子和离子在血液与脑组织之间的运输，在大脑基本营养物质供应、脑组织代谢废物外排及避免血液中有害物质对脑组织造成损伤等方面起到重要作用[15]。BBB 的结构改变与中风[16]、脑瘤[17]等疾病密切相关，BBB 功能障碍也可能会导致神经退行性疾病的发生[18-20]。BBB 对物质的选择性阻碍作用在维持脑组织的营养物质运输、限制有毒有害分子的转运的同时也阻碍了某些药物透过，导致中枢神经系统（central nervous system，CNS）药物的生物利用度降低[21]。为了深入了解BBB 的结构和功能特性，了解不同药物和化合物通过血脑屏障的渗透性需要建立合适的体外模型。

2 常用BBB 体外模型的评价方法

2.1 跨内皮电阻 跨内皮电阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）是一种测量体外培养模型中内皮细胞和上皮细胞电阻的定量技术[22]。通过测量TEER 值评价紧密连接的严整性，评估BBB 体外模型的屏障作用[23]。体外模型的TEER 值应尽可能接近体内TEER 值，通常在1800～2000 ω·cm2范围内[24]，150～200 ω·cm2被认为是功能模型中可接受的最低TEER 值[25]。

2.2 渗透性实验 BBB 的主要功能是对物质的选择性转运，通过测量其体外模型的渗透性（检测不同分子量的带电示踪剂在模型中的通透量）以评定模型的实用价值，高质量的模型应具有与体内相似的渗透性特征。评估渗透性时，选择合适的分子很重要，常用示踪剂有：异硫氰酸荧光素葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，FITC-dextran）[26]、埃文斯蓝（Evans Blue）、荧光素钠（Sodium Fluorescein）以及辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）等[27，28]。

3 基于微流控芯片的血脑屏障体外模型

微流控芯片是一种结合化学、物理、生物工程等多学科于一体的高效工具，具有低试剂消耗、高通量、易于集成的特点，目前可以实现多种人体器官体外模拟，例如肝芯片[29]，肠芯片[30]及组合芯片[31]等。器官芯片使实验人员能够以可控的方式改变局部细胞、分子、化学、生物和物理参数，精准模拟人体内微环境并加以分析。由于微流体芯片在微尺度上提供了对细胞和流体的精确控制，并且使得多功能集成成为可能，已经被用于在各种实验中模拟BBB微环境。

3.1 基于微流控芯片的BBB 体外模型的构建多数微流控芯片的制作以刻蚀技术为基础，在单晶硅、玻璃等基底材料上刻蚀出不同的通道图案制备阳膜，再利用模塑法结合高分子聚合材料制做而成。应用于微流控芯片制作的高分子聚合材料中因聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）具有光学透明，无毒，不易燃，具有较好的透气性等优良性能而被广泛应用[32]。按设计的微管道结构不同将基于微流控芯片的BBB 体外模型分为两种:垂直型和平行型。

3.1.1 垂直型BBB 体外模型 垂直型微流控BBB 模型通常由两个垂直放置的微流体结构组成，两个微流体结构由生物膜分隔，分别形成血管腔室和脑组织腔室。这种设计允许交叉通道通过多孔膜连接，多孔膜起到物理屏障作用，将两个腔室的细胞类型分开，同时仍然允许细胞间物质信号交流，并且在结构上更加接近在体情况。通过微通道控制细胞生存环境，模拟体内物质运输形式，实现细胞与细胞之间及细胞与外界的物质交换满足细胞存活和分化所需要的生理条件，如细胞与流体的体积比、流体流动所产生的剪切应力等。

蒋丽莉等[33]设计了一种微流控芯片。该芯片设计为垂直双层结构，中间用多孔聚碳酸酯膜分隔，上层培养BMECs，下层培养星形胶质细胞分别由两套流路系统进行控制，以实现模拟在体情况的血脑屏障模型构建。研究人员通过透射电镜观测到上下两层细胞均附着于透明的聚碳酸酯膜上，且上层（BMECs 侧）可见紧密连接蛋白。检测TEER 值和荧光素钠渗透实验表明该芯片能很好的模拟BBB 结构。Jeong S 等[34]将两片分别具有4 个微通道的PDMS 芯片的通道面对合，中间夹以多孔聚碳酸酯膜，在其两侧培养BMECs 和星形胶质细胞分别模拟血管和脑组织，在单个芯片上的形成16 个BBB 单元，允许在一个芯片上同时进行多达16 种不同的分析。通过测量TEER 值、右旋糖酐渗透性实验以及免疫染色分析来评价屏障功能。实验数据表明该模型形成了紧密的连接屏障，物质通透性也显著降低，屏障性能良好。

同样采用通道垂直排列的设计，Brown JA 等[35]构建了一个更完善的BBB 体外模型。他们在上层通道培养BMECs，在下层通道同时培养神经元细胞、星形胶质细胞和周细胞模拟脑组织，采用可翻转设计满足在管腔中每个面都培养细胞的需要，以支持人脑神经元细胞、星形胶质细胞、周细胞和BMECs在立体空间的生长和发育。两个腔室分别具有入口和出口以满足流体灌注，模拟了人脑神经元生长所需的结构，提供了更加近似人脑的体外环境。双重灌注特性允许对血脑屏障的任一侧进行操作，以及将药物和营养物分别输送到血管或大脑腔室，有利于评估不同化合物的渗透性及其对血脑屏障本身的影响。

垂直型BBB 体外模型提供了人类脑组织相关细胞生长所需的结构并且为BBB 长期稳定分化所需的细胞间物质交流提供了环境，因此可以满足在BBB 的背景下进行神经系统基础研究，为血脑屏障功能的建模和中枢神经系统药物毒性和渗透性的测试提供了一个新的平台。但此类模型依旧存在一定的局限性，聚碳酸酯膜是此类模型中使用最广泛的膜，由于它是光学半透明的，在实验过程中不具备通过光学显微镜观察细胞的能力。并且这些人工膜的厚度与人体内基底膜的厚度相比相对较高，限制了细胞间相互的作用，使得不同类型的细胞难以建立直接接触[36]。

3.1.2 平行型BBB 体外模型 平行型BBB 体外模型通常利用微柱或微通道阵列分隔两个平行排列的微通道，这些微结构之间的间隙很小，足以阻隔两侧的细胞，从而允许构成血管和脑组织的细胞分别在每一侧培养。微柱或微通道阵列取代了垂直型BBB 模型中多孔膜的使用，使两侧微通道中的细胞之间可以直接进行物理和生化交流。光学透明的PDMS 的使用，允许动态实时监测和使用显微镜方法直接观察BBB 的变化成为可能。

Deosarkar SP 等[37]构建的BBB 体外模型具有平行排列的内外两层结构，外层培养鼠BMECs 模拟血管，内层培养鼠星型胶质细胞模拟脑室，中间由一排并列微柱之间形成的3 μm 的间隙相通。血管通道的尺寸为200 μm×100 μm×2762 μm（宽×高×长度），其3D 几何形状和尺寸与体内微血管的大小和形态非常接近，为模拟体内流体剪切力创造了条件。ZO-1 的表达增加、和TEER 值增加以及荧光40 kDa 葡聚糖的渗透性降低证明该芯片可以形成具有功能性的BBB。该团队还通过血管室和脑室之间的3 μm 多孔界面观察到星形胶质细胞突起和/或末端，表明该设计允许在血管通道中培养的鼠BMECs和在脑室中培养的星形胶质细胞之间进行物理和生化交流，这对于形成更紧密的BBB 至关重要。Nguyen PQH 等[38]利用PDMS 与塑料聚碳酸酯（plastic polycarbonate，PC）制备了混合弹性体-塑胶微装置模拟BBB，芯片设计了3 个通道，中间通道的宽度和高度分别为500 μm 和100 μm，横向通道的宽度和高度分别为800 μm 和100 μm。通道之间由排列的微柱分隔，每根柱子宽200 μm，高100 μm。于中间通道培养星形胶质细胞，横向通道之一灌注星形胶质细胞培养基，为细胞提供营养，另一个侧通道接种人脐静脉内皮细胞（human umbilical venous endothelocytes，HUVECs）。紧密连接标记物ZO-1 的表达结果表明紧密连接形成，罗丹明phalloidin 染料实验证实肌动蛋白丝的形成，使用荧光示踪剂FITC-dextran 测试表明BBB 具有低渗透性，TEER测量值显示该模型具有良好的跨内皮电阻。

BBB 构成复杂，不同的细胞成分之间相互作用、相互影响共同维持和调控其结构和功能的完整性[39，40]。微流控芯片可以构建各种微结构，实现多种细胞的精确控制；采用注射泵控制微通道中流体的流动可以模拟人体内血流产生的剪切应力，这种剪切力可以诱导血管内皮细胞的分化，对于物质转运至关重要[41，42]；微流控芯片的物质传输能力可以及时清除细胞代谢产物，为细胞生长提供一种与人体高度近似的环境[43]。垂直和平行型微流控BBB 体外模型在具有微流控芯片共有优势的基础上又各具特点。与垂直型相比平行型在实时可视化动态过程监测方面具有显著优势。

3.2 基于微流控芯片的BBB 体外模型的应用许多传统模型难以支持BBB 形成中涉及的所有细胞类型、缺乏成熟紧密连接形成所需的流体剪切力，多种细胞所需营养物或其它物质通过扩散的方式进行补给，无法及时排除细胞代谢产物导致细胞微环境与在体情况差异较大[44]。基于微流控芯片的BBB 体外模型由于其结构优势可以克服以上问题，为模拟生理或病理条件下整个器官和器官系统的活动和反应奠定了基础[6]，为研究各种因素对BBB 的影响、肿瘤迁移机理、评估不同化合物的渗透性[45，46]等研究提供有力平台。以下将结合垂直和平行型微流体BBB体外模型不同的优势介绍基于微流控芯片的BBB体外模型的具体应用。

3.2.1 炎症反应研究 有研究表明炎症反应可以改变BBB 的结构、增加其通透性，并且这种改变会随时间而进展[47]。炎症反应对BBB 结构的改变可能依赖于细胞因子的作用。相关研究证实脂多糖可以诱导细胞因子的激活和细胞损伤[48，49]。Brown JA 等[50]采用了一种垂直型双腔微流控BBB 体外模型，研究BBB如何对两种不同但重叠的神经炎症驱动因子——脂多糖和一种由白介素-1β、肿瘤坏死因子α 和单核细胞趋化蛋白1，2 组成的细胞因子混合物做出反应。垂直型微流控BBB 模型提供了一种更加接近在体情况的结构，允许温和的介质交换并且可以维持适宜的流体剪切应力，双重灌注系统允许对血脑屏障的任一侧进行操作。他们将脂多糖和细胞因子持续灌注于BBB 模型的血管侧，并收集暴露前和暴露过程中的流出物样本，通过代谢物分析来确定炎症反应的关键途径。结果表明，脂多糖对血脑屏障的通透性、细胞因子激活和代谢活性有时间依赖性的影响，他们发现炎症刺激增加了BBB 的渗透性，减少了紧密连接的数量，并改变了代谢组学特征。

3.2.2 肿瘤迁移与治疗 脑肿瘤是指中枢神经系统中不同类型的原发性和转移性肿瘤且预后极差，通常患者生存率极低[51]。为了形成脑转移，肿瘤细胞必须穿过BBB 进入大脑[52]，其作用机制复杂[53]。有研究表明[54]，BBB 中的星形胶质细胞能够促进肿瘤细胞的侵袭。

Xu H 等[55]利用基于微流控芯片的BBB 体外模型检测人肺、乳腺和黑色素瘤细胞的脑转移及其对化疗的反应。他们设计了一种由16 个独立的功能单元组成平行微流控BBB 模型，每个BBB 单元由一个血管通道（血管室）和一个用于注入细胞外基质胶原或星形胶质细胞（脑室）的通道组成。模型的平行分隔通道设计使得操纵血管流动和将细胞和营养物独立地输送到血管室或脑室成为可能，并且方便直接用荧光电镜进行观察，允许以高分辨率和高通量的方式进行研究。通过免疫荧光分析证实了动态血流或星形胶质细胞共培养的存在可以显著增加内皮细胞紧密连接蛋白（ZO-1，克劳丁-5）和粘附蛋白（VE-钙粘蛋白）的表达。另外他们通过在血管室分别注入肿瘤细胞BEL-7402、A549、MDA-MB-231、M624 等，模拟恶性肿瘤细胞外渗的过程。通过免疫荧光染色观察证实肺癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞有能力跨越血脑屏障。Xu H 等[55]等还利用上述模型测试了八种临床相关化疗药物穿过血脑屏障的能力及其对胶质瘤细胞的细胞毒性作用。结果表明，当BBB 存在时，只有替莫唑胺（TMZ）能显著诱导胶质瘤细胞凋亡。

3.2.3 药物筛选、递送 基于微流控芯片的BBB 体外模型可以高度还原人体内微环境并且具有易于组装、方便观察的特点，可以使涉及中枢神经系统的药物相关研究更加高效。

肿瘤学中的精确医学需要针对个别癌症患者定制治疗策略，Wong AH 等[56]利用平行型的微流控BBB 体外模型筛选针对癌细胞系和从人类原发性肿瘤分离的细胞的药物。分隔通道配置使得操纵血管流动和将细胞及营养物独立地输送到血管或脑隔间成为可能，功能单元的并行设计有助于高通量的血脑屏障分析并且允许动态实时监测和使用显微镜方法直接观察BBB 变化。他们利用微流控芯片将单细胞分散在液滴中，并在药物治疗后24 h 内成像，通过乙锭同二聚体染色评估细胞活力。根据实验结果为癌症患者后续精准给药提供参考。

目前，纳米制剂给药系统因其独特的生物相容性和稳定性而得到广泛应用[57]，BBB 结合纳米技术有望对肿瘤药物产生革命性的影响[58，59]。将治疗药物封装在纳米粒子（Nanoparticles，NPs）中，利用其可以穿透血脑屏障的特性为治疗药物提供保护并将它们送到指定部位[60]。Falanga AP 等[46]使用平行微流体BBB 模型评估了一种新的用于中枢神经系统的纳米药物输送载体，发现纳米粒子与膜营养肽GH625 结合时更容易通过BBB。

3.2.4 其他 除以上应用外，基于微流控芯片的BBB体外模型还可以用于其它方面的研究。Wang Y 等[61]开发了一种微流体芯片来获得人类诱导的多能干细胞（hiPS）衍生的脑器官样细胞，以研究妊娠早期的神经发育障碍。Li Y 等[62]构建了三维人体功能性BBB 检测INPM（indoor nanoscale particulatematter，INPM）对大脑神经系统的潜在影响。Brown JA 等[63]使用由人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共同培养而成的简化微流控神经血管单元（NVU）模型研究阿片类药物进入中枢神经系统的机制。

4 总结与展望

随着对BBB 的研究不断深入，BBB 体外模型的构建的工具也在不断发展。微流控芯片结合化学、机械、生物等多学科为一体，可以模拟体内关键特征，包括流体剪切应力、细胞表型和紧密连接等，同时具有低试剂消耗、高通量、易于集成、设计灵活的特点。但目前的芯片器官模型往往过于复杂，需要高度专业化的设备。制作微流控芯片的材料在一定程度上限制了这种技术的发展，聚酯等化学吸收性差，PDMS 尽管应用广泛，化合物的吸附却使得它不适合与药物相关的研究；用作支持细胞培养和屏障构建的基膜胶原蛋白和基质凝胶价格高昂。新材料的开发，更优化的芯片设计将大力推动微流控芯片在体外血脑屏障模拟方向的发展。总体来说，微流控技术在体外模拟BBB 具有广阔前景。