结核分枝杆菌耐药基因突变检测方法的研究进展

阳 央，侯 欢，冯 智，李 慧，李芳芹*

(1.延安大学医学院；2.延安市第二人民医院检验科； 3.延安大学附属医院检验科；陕西 延安 716000)

目前，结核病仍是传染病的头号杀手，每年导致数百万人的死亡。耐药结核病诊断和治疗的延迟是造成结核持续蔓延和治疗失败的一个重要因素，我国是仅次于印度的全球耐药结核病第二大国，结核病疫情严峻。在我国结核病新疫情的背景下，传统的结核病检测方法已经不能满足当前我国结核防控的要求，尤其是耐多药、广泛耐药结核病的诊断和治疗。近年随着结核菌分子耐药机制的阐明，耐药相关靶基因突变的快速检测系统也逐步应用于临床。我们对几种结核耐药基因检测方法及研究进展进行概述。

1 结核分枝杆菌重要分子耐药机制

世界卫生组织将抗结核药物从最有效、最常用的药物(第1组)到很少使用和疗效不明确的药物(第5组)分类。结核分枝杆菌最重要的耐药机制是由于染色体上基因突变，这些突变包括单核苷酸的改变，小的插入和缺失或更大的缺失，目前相关耐药基因主要有inhA和katG(异烟肼)、rpoB(利福平)、EmbB(乙胺丁醇)、gyrA和gyrB(氟喹诺酮类)，eis(卡那霉素)，RpsL(链霉素)，rrs(链霉素，阿米卡星/卡那霉素/卷曲霉素)，pncA(吡嗪酰胺)[1]。

2 Gene Xpert MTB/RIF技术(美国Cepheid)

Xpert MTB/RIF是一个集成的、自动化的、基于墨盒的系统，与Gene Xpert仪器一起使用，用于快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药性相关突变，在两个小时内可获得结果，其操作步骤非常简单，只需要对痰进行一步前期处理即可，也不需要进行实验室分区，对实验室要求及实验人员要求不高，是一种低风险的操作程序，其生物安全的防护级别与临床上痰涂片抗酸染色镜检操作相当，但仪器试剂费用非常昂贵，因此，这种方法非常适用于大型三甲医院对疑似结核患者的快速筛查。在全球Xpert MTB/RIF广泛应用于结核病快速检测，快速检测是否有结核分枝杆菌主要针对结核分枝杆菌的IS6110靶点，可用于成人及儿童各种肺内和肺外结核标本的快速检测(痰、肺泡灌洗液、脑脊液、胃液、胸水、淋巴组织等)，除对胸水检测敏感度欠佳外，其余标本检测与培养法相当。利福平耐药性检测主要覆盖含81bp序列的rpoB基因，利福平耐药菌株中，约有95%的菌株是由于rpoB基因突变导致的，因此，快速的应用该方法检测利福平耐药性对发现耐多药结核十分重要。该方法可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTBC)和利福平耐药性，整个过程仅需2 h[2]，虽然利福平耐药并不是耐多药结核(MDR-TB)的完全替代标记，但它被认为是MDR-TB的最重要指标，因为超过90%的利福平耐药菌株同时耐异烟肼[3-4]。Xpert MTB/RIF法检测结核分枝杆菌对痰涂阳标本的临床敏感性为96.8%～99.0%，对涂阴痰标本的敏感性为65.4%～78.7%[2，5]，一项纳入36项研究的Meta分析显示Gene Xpert检测肺外结核的综合灵敏度77%，特异性97%[6]。Gene Xpert用于骨与关节结核的诊断中，敏感性高于涂片、培养和线性探针(82%对26%、48%和72%)，特异性100%[7]。在泌尿系结核中敏感性也明显高于涂片和培养(63%对18.5%和45.7%)[8]。Gene Xpert检测RIF耐药性的敏感性为87.10%～94.0%[9-10]，特异性为94%～98%[10-11]。然而对Gene Xpert来说，敏感细菌的存在会导致优先扩增曲线的出现，从而导致对耐药菌含量少RIF异质性耐药的漏检，该方法也不适用于抗结核治疗的疗效监测[12]，最近有研究说明Gene Xpert快速检测虽然使结核患者得到了及时的治疗，但患者的预后和死亡率方面并没有明显改善，同时昂贵的价格在经济落后地区造成患者的经济负担加重，在一方面该方法目前存在局限性，仅能检测MTBC和利福平耐药性[13-15]。世卫组织建议使用Xpert MTB/RIF法作为MDR-TB风险人群的初步测试，其依据是与传统培养和利福平耐药DST相似的准确性[16]，Xpert MTB/RIF的优点是，对于使用液体介质和固体介质需要几个月才能提供结果的检测，该检测方法可以在24 h内提供结果，而不是在几周内提供结果。Gene Xpert目前只能对利福平耐药性进行检测，在检测异质性耐药方面仍然存在差距，突变体在50%以上才能发现，因此，对于存在低频异质性耐药标本可能存在检测假阴性，同时该检测方法忽视了INHR-TB患者，这可能导致MDR-TB进一步产生。Xpert MTB/RIF检测是一种自动化的分子检测方法，提高了结核菌和利福平耐药的检测水平，但其敏感性在含菌量少的患者或HIV患者中是不够的，因此，近来开发了新一代的Xpert MTB/RIFUltra(Xpert Ultra)系统，该方法使用了2个不同的多拷贝结核分枝杆菌靶标，包括IS6110和IS1081，PCR体系也由原来的25 μL扩大至50 μL。研究发现在137例痰涂阴培养阳性标本，Xpert Ultra和Xpert的敏感度分别为63%和46%，115名HIV阳性者的培养阳性痰的敏感度分别为90%和77%，在所有462名痰培养阳性者中，敏感度分别为88%和83%，Xpert Ultra和Xpert对新发结核病病例检测的特异性分别为96%和98%，对有结核病病史的患者特异性分别为93%和98%，然而Xpert Ultrat在检测利福平耐药性方面与Xpert相比并没有表现出优势，两者利福平耐药性检测性能表现相似[17]。

3 Geno Type MTBDRplus

Geno MDRTBplus(Hain，德国)，它可以在一次试验中同时检测RIF和INH的耐药突变，通过检测rpoB基因突变确定利福平耐药性，同时检测KatG和inhA基因突变确定异烟肼耐药性，只需1～2 h，并且已得到了广泛的验证[18]。然而，这种基于反向杂交的检测需要多次PCR后操作，而颜色读数则需要目测。此外，由于可在膜上动员的探针数量有限，因此只涉及有限数量的频繁突变[19]。目前，国内对Geno MDRTBplus检测性能评估显示：Geno MDRTBplus检测利福平耐药性的灵敏度82.8%～97.5%，特异度99.3%～100%，检测异烟肼耐药性的灵敏度80.4%～88.2%，特异度94.9%～100%[20-23]。近年Geno MDRTBplus也开发了新一代的Geno MDRTBsl，增加了对乙胺丁醇、喹诺酮类和氨基糖苷类药物的耐药性，但因其价格因素和操作繁琐，限制了在我国的广泛使用。

4 荧光探针PCR熔解曲线法(MeltPro中国致善)

荧光探针PCR熔解曲线法是一种基于闭合管、双色、熔解曲线分析的实时PCR检测方法。该技术是基于双标记自淬探针的PCR后熔解曲线分析的一种定性诊断方法[24]，它检索了MTBC从野生型转变为基因突变型的的熔解温度(Tm)，该方法的内在特点使其能够在一次试验中覆盖与耐药性相关的两个片段(每个片段超过20个连续核苷酸)，它也很容易完成，而不需要繁琐的杂交[25-26]。目前试剂盒能同时检测五种药物耐药性包括：利福平、异烟肼、喹诺酮类、乙胺丁醇和链霉素。对利福平和异烟肼耐药性检测表现良好，通过检测结核菌的rpoB基因突变来确定利福平耐药性，通过检测KatG315密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)、inhA94密码子、以及ahpC启动子区(-44～-30位点及-15～3位点)是否存在突变来确定异烟肼的耐药性。喹诺酮类、乙胺丁醇和链霉素耐药突变的检测性能不如利福平、异烟肼，目前国内对其研究评价的报道也较少。由中国疾病预防控制中心赵雁林团队率领的一个研究组近日在Scientific Report发表文章，报道了该方法检测痰样本的临床评价结果，以MGIT 960药敏试验系统比例法为参考标准，该方法对利福平耐药性检测的灵敏度为94.2%，对异烟肼耐药性检测的灵敏度为84.9%，特异度分别为97.5%、98.0%，对二线药的灵敏度为：氧氟沙星83.3%，阿米卡星75.0%，卡那霉素63.5%[27]。此外，该方法可以识别出野生型种群中20%的突变样本，这与sanger测序所能检测到的突变率接近[26]。混合细菌样本的可探测性将使人们能够密切监测疾病状况，并及时采取替代治疗战略。重要的是，该方法检测显示与普通非结核分枝杆菌菌株无交叉反应，这一特性不仅保证了该方法的特异性，而且还可将其应用于各种临床标本。跨平台兼容性研究表明，该检测系统可以在六种实时PCR机上进行，从而使它成为市场上几乎所有主流的实时PCR仪器的一种开放的检测方法，但该检测技术对前期结核DNA的提纯要求较高，同时也会出现各种复杂的熔解曲线，这不仅需要有一定技术的实验室人员也需要有较全面的耐药机制知识的储备，因此，本文作者认为这种方法更适用于结核病专科医院对结核菌耐药性检测多种方法的相互验证。

5 全基因组测序技术(Whole-genomesequencing，WGS)

由于检测速度快，通量高，WGS已逐渐用于临床的辅助诊断中。由牛津大学领衔的全球多中心合作计划资助的一项研究，收集了临床分离的10290株结核分枝杆菌，遍及6大洲，16个国家[28]，随后针对这些菌株进行了4种一线抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)表型药敏检测和WGS分析。基于全基因组序列的药敏分析主要聚焦于9个基因以及上游调控区，这些基因区域包括：ahpC、inhA、fabG1和katG、rpoB、embA、embB和embC以及pncA。对于异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的WGS耐药性预测的灵敏度分别为97.1%、97.5%、94.6%和91.3%，特异度分别为99.0%、98.8%、93.6%和96.8%[31]。从已有的结核分枝杆菌临床菌株全基因组序列数据出发分析WHO推荐的分子检测技术(如Xpert MTB/RIF、MTBDRplus和MTBDRsl等)的检测结果，发现这些分子检测方法检测异烟肼、利福平和乙胺丁醇的敏感度显著低于基于WGS的预测(P<0.001)，但对于异烟肼和乙胺丁醇的检测，WHO推荐的分子检测技术特异性明显高于WGS的预测(P<0.001)。对于所有的4种一线药物，WGS药敏分析的阴性预测值都在98.5%以上。近年也发展了二代测序技术(NGS)，可以更全面分析抗结核药物耐药性，在一次分析中不但能获得全面的耐药信息，还可进行菌种的鉴定、致病性预测和传播方式等。NGS是被认为检测结核菌耐药性最有前途的技术，可检测敏感和耐药结核菌的混合感染，并且可以检测到1%异质性耐药。虽然NGS在各方面都表现得十分优越，但商品化在临床上的应用仍存在许多挑战，目前，基于纯培养物的二代测序技术检测耐药性结果可靠性较高，而对临床痰标本的直接测序还面临挑战，主要是直接从痰标本中提取结核DNA纯度要求高，目前基于痰标本处理后的直接测序结果不可靠。与现有的基于PCR技术的分子药敏检测方法相比，基于WGS和NGS的药敏预测具有更高的表现性能，而且WGS、NGS能检测所有的耐药相关性突变，而每一个少见突变都可能有未知的耐药表型，这为更详尽的了解结核的耐药性提供了数据。

综上所述，各种快速结核耐药性检测的分子学方法各有优势，同时存在一定局限性。结核分枝杆菌培养法及表型药敏试验仍是结核病必需的，单一的快速分子学方法具有一定限制性，需多种不同分子学方法检测工具进行相互验证，只有联合应用综合分析，可能是目前我们依靠分子学方法进行结核快速诊断和治疗的可靠依据。