SOCS7通过抑制细胞凋亡促进肺癌A549细胞增殖的机制研究

郭 奥，闫佳欣，张 翔

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

SOCS7是细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族一员，SOCS家族是由多种细胞因子诱导产生，并通过多种途径来负向调控细胞因子的信号转导(如JAK/STAT通路)的蛋白分子家族[1-2]，它们在肿瘤，免疫功能，代谢性疾病中均起着重要的调控作用[3]，SOCS作为负调控因子代表了一种抑癌基因，已成为肿瘤治疗的新靶点[4-5]，关于SOCS家族成员在肺癌的发病作用机制的研究并不多，有鉴于此，本研究以肺癌A549细胞为模型，观察SOCS7对肺癌A549细胞的增殖和迁移能力的影响，并探究其在肺癌A549细胞生长过程中的可能性作用机制。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

人肺癌A549细胞株，由延安大学医学院中心实验室保存。

1.1.1 药品与试剂 CCK8检测试剂盒，细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，BCA蛋白质定量试剂盒，小鼠抗人GAPDH抗体，人肿瘤坏死因子α(Tnf-α)酶联免疫吸附测定试剂盒，人白介素6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒，人白介素1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒，均购自碧云天生物技术有限公司；siRNA购自吉凯基因公司，兔抗人Cleaved Caspase3、兔抗人Bcl2购自美国Abcam公司，Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 仪器 CKX41光学显微镜(Olympus，日本)，Spectramax190连续波长酶标仪(BD公司，美国)，Galaxy170SCO2恒温细胞培养器(Eppendorf公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及转染 使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养，培养条件：37℃，5%CO2，每2 d更换新鲜培养液，取对数生长期细胞进行传代及实验，使用lip3000转染试剂盒进行细胞转染，分为对照组，转染空载组，过表达SOCS7组，干扰SOCS7组。

1.2.2 CCK8检测细胞增殖 取对数期肺癌A549细胞接种于96孔板中，分别于24,48，72,96,120 h使用CCK8检测试剂盒检测各组细胞增殖变化，实验重复3次。

1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移能力 收集转染后48 h的A549细胞，进行Transwell实验，使用基质胶均匀铺于细胞培养板，置于细胞培养箱中1～2 h，小室内加入A549细胞悬液，培养48 h后，吸取上室细胞悬液，使用4%多聚甲醛固定，再使用结晶紫染色，PBS清洗，用棉签擦去上室未迁移细胞，显微镜下随机选取3个视野拍照，实验重复3次。

1.2.4 ELISA实验检测TNF-α、IL-1和IL-6水平 收集转染后48 h的A549细胞，使用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1和IL-6水平变化。

1.2.5 Western blot检测相关表达蛋白 收集转染后48 h的A549细胞，以GAPDH为内参，检测Bcl-2和Cleaved Caspase3的表达变化。

1.3 统计学方法

用SPSS 22.0统计软件进行统计与分析。使用SigmaPlot软件进行统计绘图。

2 结果

2.1 SOCS7对肺癌A549细胞增殖能力的影响

CCK8实验检测所示，在过表达SOCS7时，转染96 h后，与对照组和转染空载体组对比，肺癌A549细胞的增殖力明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01，见图1A)；在干扰SOCS7时，转染96 h后，与对照组和转染control siRNA组相比，肺癌A549细胞的增殖力明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01，见图1B)。

图1 SOCS7对肺癌A549细胞增殖能力的影响

2.2 SOCS7对肺癌A549细胞迁移能力的影响

Transwell实验检测所示，干扰SOCS7时，与对照组和转染control siRNA组相比，肺癌A549细胞的迁移能力明显降低，见图2A；在过表达SOCS7时，与对照组和转染空载体组对比，肺癌A549细胞的迁移能力明显升高，见图2B。

图2 SOCS7对肺癌A549细胞迁移能力的影响

2.3 SOCS7对肺癌A549细胞凋亡相关基因的影响

Western blot实验检测所示，干扰SOCS7时，与对照组和转染control siRNA组相比，肺癌A549细胞中Bcl-2表达量显著降低，Cleaved Caspase3表达量升高，见图3A；在过表达SOCS7时，与对照组和转染空载体组对比，肺癌A549细胞中Bcl-2表达量显著升高，Cleaved Caspase3表达量下调，见图3B。

2.4 SOCS7对肺癌A549细胞免疫相关基因的影响

ELISA实验检测所示，在过表达SOCS7时，转染12 h后，与对照组和转染空载体组对比，肺癌A549细胞中人肿瘤坏死因子α(Tnf-α)和IL-1表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，IL-6无显著性变化，转染24h后，与对照组和转染空载体组对比，IL-6表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01，见图4A)；在干扰SOCS7时，转染12 h后，与对照组和转染control siRNA组对比，肺癌A549细胞中人肿瘤坏死因子α(Tnf-α)和IL-1表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，IL-6无显著性变化，在转染24 h后，与对照组和转染空载体组对比，IL-6表达量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01，见图4B)。

图3 SOCS7对肺癌A549细胞凋亡相关基因的影响

图4 SOCS7对肺癌A549细胞免疫相关基因的影响

3 讨论

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,而且是我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。在肺癌患者当中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)发病率最高，约占80%。研究显示，许多自身免疫性疾病和恶性肿瘤均由炎症诱发，或是因炎症而恶化。研究表明，SOCS7分子可通过三种不同的方式调节细胞因子信号通路[6]。

本研究显示，在肺癌A549细胞中干扰SOCS7，Caspase-3蛋白表达量显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低，肺癌A549细胞的增殖力显著降低，与前人研究结果一致[7-9]，而且在肺癌A549细胞中干扰SOCS7时，Transwell结果表明肺癌A549细胞的迁移能力明显降低；研究发现：白介素(Interleukin,IL)与炎症反应的发生具有密切联系，与NSCLC的发生密切相关，在肺癌的发病过程中有IL-6的参与[10]。

肿瘤细胞产生的促炎和促恶病质因子在恶病质的发生中起着重要作用，许多促炎细胞因子，如白介素-1(IL-1)，IL-6，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在癌症恶病质的病理机制中可能起重要作用[11]。Tnf-α作为主要的I型干扰素，通过炎症反应的发生对侵入机体的病原体进行非特异性的清除，过度的I型干扰素反应也会造成机体的免疫病理损伤[12]，本研究通过ELISA实验检测发现，在干扰SOCS7 12 h后，肺癌A549细胞中人肿瘤坏死因子α(Tnf-α)和IL-1表达量显著升高，此时，IL-6无显著性变化，在转染24 h后，IL-6表达量显著升高，表明在肺癌A549细胞中通过SOCS7作用IL-6与作用时间相关。

本研究显示，干扰SOCS7能够抑制肺癌A549细胞的增殖和迁移能力，降低Bcl-2蛋白表达量，提高Caspase-3蛋白表达量，Tnf-α和IL-1表达量也显著升高，提示SOCS7可能通过炎症反应和Caspase-3途径来调节肺癌A549细胞的生长。