盐霉素抗肿瘤作用及其机制研究进展

韩 笑，申文娟，杜 娟，罗梦圆，马西元，赵菊梅

(延安大学医学院医学实验中心，延安市肿瘤防治重点实验室，陕西 延安 716000)

盐霉素(salinomycin，SAL)系一类一元羧酸聚醚类动物专用抗菌药物，存在特殊环状结构，由白色链霉菌发酵后产生，系典型离子载体型抗菌药物，对细胞钾离子、钠离子、碱金属离子存在高亲和力，通过阻止细胞内阳离子传输，引起细胞内外离子浓度改变，进而调节渗透压，促使细胞裂解，产生杀菌效应。对各类球虫及大部分革兰氏阳性菌均有较强的杀灭及抑制作用，且不易产生耐药性，一般无交叉抗药性，代谢速度快，药物蓄积及残留量极低，常用于家禽球虫防治[1]。SAL对于分歧杆菌、表皮葡萄球菌、疟原虫、球虫类生物都有消灭、抑制作用，因此过去的三十多年中被广泛应用于家禽球虫病的治疗[2]。SAL抗虫谱广，对鸡柔嫩、毒害、堆型、巨型、布氏、和艾美耳球虫防治效果皆可，同时对鹌鹑分散、莱泰艾美耳球虫亦有高效，且对革兰阳性厌氧菌有较强的杀菌作用，另外盐霉素也存在有效的促生长作用[3]。近年来，将盐霉素用于抗肿瘤作用的研究发现，SAL可抑制乳腺癌干细胞的生长，动物实验也证实，SAL成分可杀灭鼠乳腺癌模型肿瘤干细胞，抑制癌细胞新生[4]，同时也显示出对多种肿瘤干细胞的抑制作用，并对其作用机制进行了较深入的研究，最新研究显示SAL可通过诱导细胞自噬抑制人胃癌细胞系增殖[5]，也有报道SAL能够逆转癌细胞放疗抵抗及多重耐药，或可能为癌症防治提出新的思路[6]，为抗癌药物研发提供了参考。

1 SAL理化性质及应用

SAL分子量约为772.99，分子式C42H69O11Na，结构式见图1，含不饱和六元环，熔点为113℃。SAL系从白色链霉菌发酵分离的单羧基聚醚类离子型抗菌药物，含三螺环缩酮结构，对碱金属离子有高选择性，主要通过与钾离子结合，促细胞内钾离子外流，抑制线粒体磷酸化及氧化反应，阻碍球虫体内离子运转及平衡，在较长时间均作为抗菌药物使用，最初用于各类球虫感染家禽防治中[3]，同时可促进反刍动物生长，提高饲料转化率。如目前常用抗球虫药包括化学合成抗球虫药及与SAL类似的聚醚类离子载体抗生素，包括拉沙里菌素、莫能菌素等，但SAL药物毒性低，价格低廉，故应用相对广泛。

图1 SAL分子结构式

2 SAL抗肿瘤效应及机制

SAL属于羟基聚醚类钾离子载体抗生素，1974年国外学者宫崎在筛选新的抗生素时，从白色链霉菌的发酵液中分离提取出这种新型活性物质。进入21世纪初期，有国外学者先后肯定了SAL在多种癌细胞中的治疗作用。2009年有研究者首先发现SAL可选择性杀灭乳腺癌肿瘤干细胞，效率较紫杉醇高百倍左右。随后越来越多研究发现，SAL可诱导乳腺癌以外的多种癌细胞凋亡，诸如乳腺癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等。Zhou，等[7]发现，SAL可提升癌细胞对药物治疗的敏感性，诱导癌细胞凋亡，抵抗其耐药。Kamdje AHN，等[8]人的研究结果显示，Hedgehog、Wnt及Notch信号均参与肿瘤干细胞发生进展过程，与放化疗抵抗、不良预后有密切相关。这些报道和试验使SAL在肿瘤中的作用受到了越来越多的关注。国内卢颖，等[9]发现，SAL可通过抑制Notch信号通路与Hedgehog信号通路抑制肿瘤干细胞增殖。Fuchs D，等[10]发现，SAL可克服多类癌细胞耐药，通过损伤肿瘤DNA、活化抑癌基因p53，提高肿瘤干细胞对细胞毒性药物及放疗的敏感性，促进癌细胞凋亡。Tsakiris N，等[11]人的实验研究发现，单用SAL存在较强的细胞增殖抑制作用，而与伊立替康联用可协同强化抑癌作用。但对SAL抗肿瘤确切机制尚不明确。SAL此类特性为抑制肿瘤干细胞治疗癌症提供了新方向。

2.1 SAL对乳腺癌的抗肿瘤效应

乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性疾病类型，发病率有逐渐上升趋势，且趋向年轻化[12]。目前临床上尚缺乏乳腺癌特异性的治疗方式，多以手术及其联合放化疗治疗为主，但仍有部分出现放化疗抵抗导致治疗失败，出现肿瘤复发及转移。SAL对乳腺癌干细胞有潜在的杀灭作用，其对Wnt/β-catenin信号的抑制能够促进LRP6下调，所以乳腺癌细胞表面Wnt受体可能成为乳腺癌治疗的新靶点。Versini A，等[13]发现，SAL在减少乳腺癌干细胞方面作用优于常规化疗药物，进入人体后能够通过干扰细胞内外金属阳离子表达，导致干细胞失活，从而发挥抗肿瘤的效应，SAL衍生物通过溶酶体铁蓄积选择性靶向杀伤乳腺癌干细胞。Gao J，等[14]人研究发现，经SAL处理后乳腺癌细胞株MCF-7mRNA及蛋白含量降低，证实SAL对乳腺癌干细胞增殖有显著抑制作用，同时可减少乳腺癌干细胞数量。陈思远，等[15]人的研究结果显示，SAL可逆转转化生长因子β1所诱导的乳腺癌细胞迁移及侵袭。Tyagi M，等[16]发现，SAL也可诱导多药耐药乳腺癌细胞线粒体功能障碍。诸多的研究表明盐霉素可以通过多种信号转导通路抑制乳腺癌细胞的生长，为进一步的开发和应用提出了大量的依据。

2.2 SAL对肝癌的抗肿瘤效应

肝癌系全球范围内五大常见恶性肿瘤之一，位列癌症死因前列。统计报道全球每年罹患肝癌人数超过50万。大部分肝癌患者接受常规放化疗、手术或消融等治疗后仍有较高的复发率，5年生存率极低，预后差[12]。临床试验发现，SAL在体内及体外均存在抑制肝癌增殖作用，可诱导肝细胞凋亡[17]。同时有研究显示，SAL通过P53非依赖途径诱导肝癌细胞早期凋亡发挥抗肿瘤效应[18]。王凡，等[19]人建立了裸鼠肝脏原位肿瘤模型，经腹腔注射SAL，观察细胞转移侵袭情况，发现SAL可通过抑制Wnt/β-catenin通路途径抑制肝癌细胞体外增殖，且存在明显浓度依赖性。经过盐霉素处理后的肝癌细胞株转移和侵袭能力显著下降，肝内转移灶的数量也明显下降，盐霉素在体内与体外都抑制了肝癌的转移与侵袭，但对于其抑制转移的机制还缺乏较深入的研究，这一研究为抑制肝癌转移和复发提供了新方向。

2.3 SAL对肺癌的抗肿瘤效应

肺癌是发病率及死亡率增长最高的恶性肿瘤类型。据统计，每年因肺癌死亡人次超过100万，每年新增肺癌病例超过120万[12]，对于肺癌治疗方式及新药的研发也是目前面临的重要课题。曾葭，等[20]发现，SAL可减少肺腺癌A549/DDP细胞p-LRP6蛋白表达，通过Bcl-2/Bax途径及诱导线粒体凋亡途径促进肺腺癌细胞凋亡，经SAL处理后细胞色素C及钙离子表达上升，引起Bcl-2/Bax通路线粒体凋亡，并发挥抑癌作用。也有学者发现[21]，SAL对肺癌细胞株存在较高的体外抗癌活性，可抑制肺癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，SAL可通过抑制Wnt通路限制肺癌癌细胞增殖，且Hsp90抑制剂对胸苷磷酸化酶表达的抑制增强了SAL对人非小细胞肺癌细胞的杀伤作用，提示盐霉素与Hsp90抑制剂联合将增强SAL的抗肺癌的效果。以上实验结果均表明SAL单用或联合用药均可以抑制肺癌细胞的增殖，或可能为肺癌治疗提供新思路。

2.4 SAL对卵巢癌的抗肿瘤效应

卵巢癌是女性妇科恶性肿瘤中死亡率最高的肿瘤类型，大部分就诊时已进展至中晚期，伴远处转移或腹膜种植，有高复发率及转移风险。刘静，等[22]人对卵巢癌常用的化疗药物耐药进行研究，SAL属于多药耐药蛋白抑制剂，这种蛋白能够让化疗药物大量聚集在细胞中，进而消灭肿瘤干细胞，比较卵巢癌干细胞(OCSCs)对顺铂和SAL的敏感性，结果显示，SAL的药物敏感性要显著高于顺铂，且SAL的杀伤力也更加理想。同样在最新研究[23]中，发现单独使用SAL降低了OCSCs的标记表达和成球能力。仅用紫杉醇治疗并没有降低OCSCs的生存能力。两药联合应用可降低OCSCs的生存能力，促进细胞凋亡。将SAL与其他抗癌治疗药物联合使用有望成为靶向OCSCs的卵巢癌治疗方法。

2.5 SAL对前列腺癌的抗肿瘤效应

前列腺癌在西方国家发病率位居男性恶性肿瘤首位。目前对前列腺癌的治疗以手术及药物去势治疗为主，但晚期前列腺癌常出现雄激素抵抗，去势治疗疗效不佳。有研究发现[24]，盐霉素可阻滞前列腺肿瘤细胞周期、诱导细胞发生铁死亡，从而抑制前列腺肿瘤细胞转移能力，14-3-3ζ蛋白可作为盐霉素发挥药效的靶点之一;而杨侃侃[25]发现，SAL可通过诱导ATP2A3表达，活化Bip-PERK通过，诱导前列腺癌PC-3细胞株内质网应激，这为临床应用盐霉素治疗前列腺癌提供了实验依据。

2.6 SAL对其他类型种类的抗肿瘤效应

赵毅，等[26]发现，SAL可抑制急性早期幼粒细胞白血病NB4细胞增殖，并可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路诱导细胞分化。Lu，等[27]人已经证明SAL选择性地诱导慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡，提示盐霉素或可作为抗白血病药物应用。研究显示[28]，SAL在体外可有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖，诱导胃癌细胞自噬凋亡，抑制人结肠癌细胞株SW480的生长。Zhang GN，等[29]发现SAL与吉西他滨联合应用能更有效抑制人胰腺癌细胞增殖。以上报道证实SAL可能通过多途径发挥抗肿瘤效应，或可能为抗肿瘤治疗的新靶点。

3 SAL抗肿瘤作用机制

3.1 SAL逆转上皮间质转化

上皮间质转化系上皮细胞转化为具间质表型细胞的过程，在此过程中细胞黏附分子减少，角蛋白骨架发生转化。已被证实上皮间质转化与恶性肿瘤侵袭转移有关。研究[19]发现，小鼠肝移植瘤模型内SAL存在显著抑癌作用，可促进癌细胞向上皮细胞分化，且体外试验证明SAL处理癌细胞可激活FOXO3a，E-cadherin表达增高，Vimentin表达下降，抑制肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)。文献研究[30]证实，盐霉素逆转TGF-β1诱导的乳腺癌MCF-7细胞的侵袭、迁移并抑制TGF-β1诱导的MMP-2高表达，盐霉素有效逆转TGF-β1诱导的MCF-7细胞EMT过程的发生，其机制是通过抑制TGF-β1诱导的Smad以及non-Smad(包括Wnt/β-cadherin和p38MAPK)信号通路的激活，在人乳腺癌组织内，β-cadherin与E-catenin的表达也呈负相关，提示盐霉素作为TGF-β1的有效抑制剂对乳腺癌的侵袭、转移存在抑制作用。推测SAL或可能通过逆转肿瘤上皮间质转化发挥抑癌作用。

3.2 SAL通过抑制Wnt/β-catenin通路诱导癌细胞凋亡

Wnt/β-catenin信号通路系介导Wnt信号转导的主要途径，参与细胞更新、增殖、分化及凋亡过程，在肿瘤演变、进展过程中发挥重要作用。该信号通路级联激活依赖于Wnt分子结合Fzd受体、脂蛋白受体相关蛋白的共轭受体，三者在细胞表面形成三元复合物，Wnt/Fzd/脂蛋白受体复合物磷酸化在细胞内高度保守PPPSPxP序列，脂蛋白受体相关蛋白磷酸化后招募轴蛋白进入细胞膜，吞噬进入细胞，β-catenin破坏三元复合物活性，导致细胞内β-catenin蓄积，转运进入核结合晚期基因表达调控因子/转录因子DNA结合因子，转变为转录激活抑制，发挥转录Wnt靶基因作用，Wnt激活或β-catenin破坏复合物突变均可造成对应基因过表达，诱导癌细胞大量释放，导致癌症发病。一般成熟细胞内，Wnt/β-catenin信号通路处于沉默状态，相关蛋白浓度水平低，而当细胞质内Wnt/β-catenin相关蛋白浓度上调，Wnt信号通路激活时，可导致相关蛋白转移至细胞核内，与转录因子家族成员结合，激活各类原癌基因表达，诱导癌细胞增殖、分化，促进肿瘤进展。已证实胃癌、肝癌、前列腺癌患者均存在Wnt/β-catenin通路异常激活表现。杜宏超[31]研究发现，Wnt/β-catenin通路激活可导致裸鼠成瘤能力增强，而SAL可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞增殖，缩小肿瘤体积。陈冬杰，等[32]发现，SAL可降低鼻咽癌细胞系β-catenin蛋白表达，降低癌细胞侵袭性。同时，SAL为有效Wnt/β-catenin通路抑制剂，可阻断Wnt通路共同受体脂蛋白受体相关蛋白6磷酸化进程，诱导慢性淋巴白血病细胞凋亡[27]。以上报道均提示SAL抗肿瘤机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路活性密切相关。

3.3 SAL通过Akt/PKB信号通路发挥抑癌作用

Akt/PKB信号通路为原癌基因通路，在癌症发展及胰岛素代谢中发挥关键作用。整合素、B细胞核T细胞受体、受体络氨酸激酶、G蛋白偶联受体等均可激活Akt级联反应，可促进PI3L释放磷脂酰肌醇3、4、5-三磷酸，调控癌细胞生长。Akt作用于mTOR及核糖体S6蛋白激酶信号通路可调控癌细胞生长，其作用于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制分子后可间接影响细胞周期蛋白及p53基因水平，调控细胞周期及细胞增殖信号；同时可通过直接抑制Bad等转录因子促凋亡信号，导致细胞存活。而经SAL处理可增加AKt活性，提升Akt磷酸化水平，升高PTEN，下调PI3K、mTOR及4E-BP、ps6蛋白激酶表达，抑制癌细胞侵袭性，发挥抗癌作用[33-34]。提示SAL可通过调节Akt/PKB通路信号介导下游mTOR信号通路发挥抗癌作用。

3.4 SAL通过干扰肿瘤细胞周期诱导癌细胞凋亡

目前认为癌细胞增殖活跃与细胞周期调控失调存在紧密联系。已知在多种癌细胞内细胞周期素D1均可促成细胞周期G1向S期转化。通过抑制细胞周期转化可抑制癌细胞增殖及进展。研究发现[35]SAL诱导胶质瘤U87细胞S期和U251细胞G1期细胞周期抑制，同时CyclinA、CDK-2、CyclinB1和CyclinD1表达下调。SAL通过降低视网膜母细胞瘤蛋白E2F1、cyclinD和CDK4的表达，诱导G1期阻滞和凋亡[36]。Tyagi M，等[16]发现，SAL可诱导乳腺癌细胞DNA损伤并诱导细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡，推测SAL可通过干扰细胞周期进而诱导细胞自噬，促进癌细胞凋亡。我们推测SAL可下调细胞G1期向S期、G2期转变的关键周期蛋白cyclinD1与B1表达而诱导癌细胞凋亡。

3.5 SAL通过诱导细胞自噬发挥抗肿瘤作用

细胞自噬系细胞自身清除损伤或细胞器及错误折叠蛋白质的降解过程，在维持机体内环境及基因完整性方面有关键作用。自噬缺陷有助于肿瘤形成、增殖及转移。前期已被证实抑制癌细胞自噬存在化疗增敏效应[37]。也有报道发现[38]，SAL诱导癌细胞凋亡与细胞自噬有关，其作用于肿瘤细胞可引起细胞自噬、凋亡及坏死。Kim KY，等[39]发现，SAL通过活化AMPK途径强化细胞自噬作用，在小鼠肝癌模型中，发现口服SAL可激活AMPK和自噬相关蛋白促进癌细胞自噬。研究发现[40]，盐霉素诱导的自噬是复杂的，可由细胞内活性氧升高而激活自噬;可通过损伤线粒体引发线粒体自噬;可引起内质网应激，通过AKT1-mTOR信号通路激活自噬，同时盐霉素可抑制癌细胞自噬潮的晚期阶段，有助于肿瘤微环境的破坏和发挥抗肿瘤作用。SAL也可抑制移植瘤趋化因子受体及肿瘤相关纤维细胞分泌炎症因子表达，减少癌细胞浸润，通过破坏肿瘤微环境，抑制癌细胞侵袭、转移。我们推测，SAL诱导癌细胞自噬机制相对复杂，可通过内质网应激、损伤线粒体、改变肿瘤微环境等途径介导自噬发生，或可能为抗肿瘤治疗的新热点。

4 结语及展望

SAL作为新型抗肿瘤药物，对多种肿瘤细胞表现出选择性靶杀伤作用，但其作用机制还有待于进一步的研究。尽管SAL能够进入临床治疗无明显定论，但是其抗凋亡、有效杀死干细胞以及抑制肿瘤生长的作用为恶性肿瘤的治疗提供了全新的方向。且目前SAL研究多停留在实验室阶段，对其副作用的研究报道较少见，在安全性方面仍需要深入的研究和探讨包括对骨骼肌、心肌的伤害，以及联合用药如何减少药物不良反应的发生等问题都需要加深研究。联合用药在克服肿瘤耐药方面也需要更深入的研究，如何利用联合用药达到最优治疗效果，以及如何减少药物的不良反应，很有可能成为未来的研究热点。其抗肿瘤机制及安全性仍需进一步进行深入研究。