大蒜素诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的作用机制研究

贾丽 孙翠荣 成艳梅 李研 张凯

摘要 目的：探讨大蒜素诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的作用机制。方法：分别以二甲基亚砜（空白对照组）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL干預对数生长期Ishikawa细胞。48 h后，用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术分析细胞凋亡状况，Western Blotting法检测p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果：与空白对照组比较，经大蒜素12.5、25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干预能够提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率;经大蒜素25、50 μg/mL或LY294002 5 μg/mL干预能够下调p-PI3K、p-AKT、Bcl-2表达并上调Cleaved Caspase-3、Bax表达，提高Bax/Bcl-2比值，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与LY294002组比较，经大蒜素50 μg/mL干预能够提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率，下调p-PI3K、p-AKT表达并上调Cleaved Caspase-3、Bax表达，提高Bax/Bcl-2比值，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：大蒜素能够诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡，可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化而使其下游促凋亡蛋白表达上调有关。

关键词 大蒜素;子宫内膜癌;LY294002;Ishikawa细胞;增殖;凋亡;磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B;机制

Abstract Objective：To investigate the effects and mechanism of Allicin on apoptosis of Ishikawa cells in human endometrial carcinoma.Methods：Ishikawa cells in logarithmic growth phase was treated with DMSO（blank control group），Allicin（12.5，25，50 μg/mL） and LY294002 5 μg/mL.48 h later，the cell proliferation inhibition rate was detected by CCK-8 method，cell apoptosis was analyzed by flow cytometry，and protein expression of p-PI3K，p-AKT，Cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax were detected by Western blotting.Results：Compared with the blank control group，intervention of Allicin 12.5，25，50 μg/mL and LY294002 5μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT，Bcl-2 and up-regulate the expression of Cleaved Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the LY294002 5μg/mL group，intervented by Allicin 50 μg/mL could increase Ishikawa cells proliferation inhibition rate and apoptosis rate，down-regulate the expression of p-PI3K，p-AKT and up-regulate the expression of Caspase-3，Bax，increase the ratio of Bax/Bcl-2，all of which were statistically significant（P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Allicin can induce apoptosis of human endometrial cancer Ishikawa cells，which may be related to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway activation and up-regulation of downstream pro-apoptotic proteins.

Keywords Allicin; Endometrial cancer; LY294002; Ishikawa cells; Proliferation; Apoptosis; PI3K/AKT; Mechanism

中图分类号：R285.5;R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.011

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的一种恶性上皮肿瘤，发病率仅次于宫颈癌居第2位，晚期患者5年生存率不足50%[1]。并且随着肥胖、糖尿病等高危人群的增加，子宫内膜癌发病率呈逐年上升且年轻化趋势，严重威胁着女性的生命健康[2]。

大蒜素是天然存在于大蒜鳞茎中的一种二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化以及广泛的抗肿瘤活性[3-6]。本研究发现大蒜素能够抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长并增强其顺铂化疗敏感性[7-8]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路对细胞增殖和抗凋亡具有关键的调控作用[9-11]，本研究以Ishikawa细胞为受试细胞，探讨大蒜素对子宫内膜癌细胞凋亡的影响以及PI3K/AKT信号通路在其中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人子宫内膜癌Ishikawa细胞株由河北医科大学病理教研室提供。

1.1.2 药物 大蒜素注射液（上海禾丰制药有限公司，批号：4E41025），规格5 mL：60 mg;LY294002（Sigma公司，美国，批号：L9908）。

1.1.3 试剂与仪器 胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM高糖培养基、RIPA裂解液（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：190514、190427、190605、190517）;CCK-8试剂盒（苏州宇恒生物有限公司，批号：190115）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京恩晶生物有限公司，批号：20190130）;磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、Cleaved Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：201812017、201903022、201901029、20190302、20190118）;DAB显色试剂盒（北京中山金桥生物科技公司，批号：20180609）;CO2细胞培养箱（三洋公司，日本，型号：MCO-15AC）;酶标仪（Labsysterms公司，芬兰，型号：Multiskan Asent）;流式细胞仪（Partec公司，德国，型号：CyFlow Counter）;垂直电泳槽、转膜槽、凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国，型号：Tetra Systerm、Power Pac Basic、GelDoc EZ）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人子宫内膜癌Ishikawa细胞经解冻复苏后接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基，置CO2细胞培养箱（5%的CO2、恒温37 ℃、饱和湿度）中培养，2 d换液1次。本研究方案经邯郸市中心医院伦理委员会审核批准。

1.2.2 CCK-8法测定Ishikawa细胞增殖抑制率   待Ishikawa细胞生长至对数生长期后，经胰酶消化并制备浓度为5×104个/mL的单细胞悬液，100 μL/孔接种于96孔板，置CO2培养箱继续培养待细胞贴壁后，分别给予DMSO（空白对照组）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL作为观察组，每组设10个复孔;48 h后10 μL/孔加入CCK-8试剂，培养箱内继续孵育2 h后通过酶标仪测定450 nm处吸光度值（OD450 nm），增殖抑制率（%）=（1-观察组OD450 nm/空白对照组OD450 nm）×100%

1.2.3 流式细胞术分析Ishikawa细胞凋亡状况并计算凋亡率 取对数生长期Ishikawa细胞经胰酶消化后制备浓度5×104个/mL的单细胞悬液，100 μL/孔接种于6孔板，置CO2培养箱继续培养待细胞贴壁后，分别给予DMSO（空白对照组）、大蒜素（12.5、25、50 μg/mL）和LY294002 5 μg/mL作为观察组，每组设10个复孔;48 h后胰酶消化、离心（离心半径10 cm、转速1 500 r/min、时间5 min）。弃上清液，经4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，70%乙醇固定1 h，预冷PBS洗涤2次后，按照试剂盒操作说明，400 μL/孔加入结合缓冲液重悬细胞，5 μL/孔加入Annexin V-FITC避光4 ℃染色15 min后，通过流式细胞仪分析细胞凋亡状况并计算凋亡率。

1.2.4 Western Blotting法检测Ishikawa细胞蛋白表达 取对数生长期Ishikawa细胞经胰酶消化后离心（离心半径10 cm、转速1 500 r/min、时间5 min）。弃上清取细胞，经RIPA裂解液冰上裂解40 min，4 ℃离心（离心半径10 cm、转速12 000 r/min、时间15 min）取上清液，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，沸水浴蛋白变性后，40 μg总蛋白上样行10% SDS-PAGE凝胶电泳（80 V电压浓缩胶电泳、120 V分离胶电泳），90 V电压转聚偏氟乙烯（PVDF）膜后5%脱脂牛奶室温封闭1 h，滴加兔抗人目标蛋白、β-actin一抗恒4 ℃孵育过夜，充分洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗于室温孵育1 h，洗膜后滴加DAB显色;以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0软件软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制率测定结果 与空白对照组比较，大蒜素12.5、25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞增殖抑制率显著提高（P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组细胞增殖抑制率顯著提高（P<0.05）。见表1。

2.2 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡状况检测结果 与空白对照组比较，大蒜素12.5、25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞凋亡率显著提高（P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组细胞凋亡率显著提高（P<0.01）。见图1、表1。

2.3 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达检测结果 与空白对照组比较，大蒜素25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著下调（P<0.05或P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组p-PI3K、p-AKT表达显著下调（P<0.01）。见图2，表2。

2.4 各组人子宫内膜癌Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果 与空白对照组比较，大蒜素25、50 μg/mL组和LY294002 5 μg/mL组Ishikawa细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著上调而Bcl-2表达显著下调（P<0.05或P<0.01）;与LY294002 5 μg/mL组比较，大蒜素50 μg/mL组Cleaved Caspase-3、Bax表达显著上调（P<0.01），2组Bcl-2表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3，表3。

3 讨论

目前，手术切除并辅以放化疗仍是临床治疗子宫内膜癌的首选方案，然而化疗药物不良反应显著并易形成耐药性，从而导致复发和病灶转移[12]。病理生理学研究发现，子宫内膜癌疾病进展与癌细胞异常增殖和凋亡抑制密切相关，因此以诱导癌细胞凋亡为靶点开发新型抗癌药物，或许对改善子宫内膜癌患者生命质量、延长生存期具有重要意义。

近年来，中医药在肿瘤治疗中越来越受重视，大蒜为百合科葱属植物，其鳞茎可入药，性温，味辛、甘，具有温中健胃、消食理气之功效。大蒜素是大蒜鳞茎的主要活性成分，具有广泛的抗肿瘤活性，能够促进人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞、人白血病HL-60细胞、大肠癌Lovo细胞凋亡[13-15]。本实验以人子宫内膜癌Ishikawa细胞为受试细胞，研究发现经大蒜素或LY294002干预能够显著提高Ishikawa细胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素具有诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡并抑制其增殖的作用。

细胞凋亡是一种程序化细胞死亡过程，该过程有多种基因蛋白参与调控，其中Caspase家族和Bcl-2家族蛋白发挥着重要调控作用。Caspase-3被细胞色素C激活后参与细胞凋亡的启动和执行过程，是凋亡级联反应最关键的促凋亡蛋白酶[16]。Bcl-2家族蛋白可分为抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类，其中Bcl-2是位于线粒体膜上的一种膜蛋白，能够通过调控线粒体膜通透性而抑制细胞色素C释放，抑制Caspase-3活化、抑制Ca2+超载等而发挥抗凋亡作用;Bax则能够与Bcl-2形成异源二聚体而抑制其抗凋亡活性，并且能够破坏线粒体膜的完整性而導致细胞色素C的释放，激活Caspase-3而诱导细胞凋亡[17]。

PI3K/AKT信号通路在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用，AKT是PI3K下游信号分子和靶激酶，p-PI3K能够促进AKT发生磷酸化（p-AKT）而被激活，p-AKT诱导具有促凋亡作用的糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，能够抑制Caspase-3活化而抗凋亡，并且p-AKT能够抑制促凋亡蛋白Bax的合成[18-20]。本研究发现，经大蒜素或LY294002干预能够有效下调人子宫内膜癌Ishikawa细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达，上调Cleaved Caspase-3、Bax蛋白并下调Bcl-2表达，并且大蒜素50 μg/mL对p-PI3K、p-AKT、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达的调控作用优于LY294002 5 μg/mL。

综上所述，大蒜素能够诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡，机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化而使其下游促凋亡蛋白表达上调有关。

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（2020-06-04收稿 责任编辑：张雄杰）