基于网络药理学探究丹参治疗慢性肝炎的作用机制

2021-11-29霍苏崔鹤蓉顾昱昊戴子琦李文刘小靖韩娜娜马涛王鹏龙雷海民

世界中医药 2021年20期

霍苏崔鹤蓉顾昱昊戴子琦李文刘小靖韩娜娜马涛王鹏龙雷海民

摘要目的：運用网络药理学的方法预测丹参治疗慢性肝炎的主要活性成分、靶点及信号通路，探究其潜在作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选丹参的有效成分;输入Pharm Mapper数据库获得相应基因;检索GeneCards数据库获得慢性肝炎的靶点基因;利用R语言3.6.3截取交集网络获得潜在靶点;使用Cytoscape3.7.2将“中药-化合物-靶点-疾病”网络可视化处理;在STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;利用DAVID数据库对候选靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路注释。结果：获得丹参中65个活性化合物、109个不重复的靶标信息、89个慢性肝炎治疗靶点。GO功能富集得到GO条目48个（P<0.05），其中生物过程（BP）条目1 796个，细胞组分（CC）条目73个，分子功能（MF）条目130个;KEGG通路富集得到88条信号通路（P<0.05）。结论：丹参中的有效成分异隐丹参酮（Isocryptotanshi-none）、1，2，5，6-tetrahydrotanshinone、丹参醌新酮Ⅰ（MiltiononeⅠ）、二氢丹参内酯（Dihydrotanshinlactone）、4-methylenemiltirone、丹参酮Ⅱa（TanshinoneⅡa）、木犀草素等可能作用于ADRB2、OPRM1、PTGS1、CA2、PTGS2等关键靶点通过调控Hepatitis B、IL-17 signaling pathway、Hepatitis C、T cell receptor signaling pathway、PI3K/AKT signaling pathway等干预了活性氧代谢过程、循环系统血管功能、氧化应激反应、凋亡，从而发挥治疗慢性肝炎的作用。

关键词网络药理学;丹参;慢性肝炎;药物作用机制;靶点;信号通路;生物功能

Abstract Objective：To predict the main active components，targets and signal pathways of Radix Salviae Miltiorrhizae in the treatment of chronic hepatitis and to explore the mechanism of action.Methods：The effective components of Radix Salviae Miltiorrhizae were screened by TCMSP database.The corresponding genes were obtained by entering Pharm Mapper database.The target genes of chronic hepatitis were obtained by searching GeneCards database.We used R language 3.6.3 intercept intersection network to obtain candidate targets; With the help of Cytoscape 3.7.2，the network of “drug-compound-target-disease” was visualized.We built PPI network on STRING platform; the DAVID database was used for GO enrichment analysis and KEGG pathway annotation of the candidate targets.Results：A total of 65 effective compounds，109 non-repeated targets and 89 disease treatment targets were obtained.There were 48 GO items（P<0.05），among which 1796 were biological process（BP） items，73 were cell components（CC） items，and 130 were molecular function（MF） items.There were 88 signal pathways enriched by KEGG pathway（P<0.05）.Conclusion：The effective ingredients of Radix Salviae Miltiorrhizae Isocryptotanshi-none，1，2，5，6-tetrahydrotanshinone，miltionone I，dihydrotanshinlactone，4-methylenemiltirone，Tanshinone IIa，Luteolin may act on key targets such as ADRB2，OPRM1，PTGS1，CA2，and PTGS2 by regulating Hepatitis B，IL-17 signaling pathway，Hepatitis C，T cell receptor signaling pathway，PI3K-AKT signaling pathway，etc.，intervening in the process of reactive oxygen metabolism，circulatory system vascular function，oxidative stress response，apoptosis，and thus play a role in the treatment of chronic hepatitis.

Keywords Network pharmacology; Radix Salviae Miltiorrhizae; Chronic hepatitis; Drug mechanism; Targets; Signaling pathway; Biological function

中图分类号：R285;R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.006

慢性肝炎是一类肝病的统称，人体被病毒感染，饮食不当、过度操劳、情志郁结等对肝脏的损害引起的，病程至少持续6个月以上的肝脏坏死和炎症，是对肝脏慢性变态性损害过程[1-6]。慢性肝炎主要有慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B）;慢性丙型肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）;由于体内的自身免疫过度造成的，称为自身免疫性肝炎（Autoimmune Hepatitis，AIH），常见于妇女[4];慢性酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）和由长期服用某些药物引起的药物性肝损伤（Drug-induced Liver Injury，DILI）比如甲基多巴、异烟脐、醋氨酚等[7]。慢性肝炎按病重可分为轻、中、重度慢性重型肝炎。慢性肝炎的共同特征，即：不同程度的肝组织坏死和炎症，随后发生肝纤维化，最终可发展为肝硬化[8]。

慢性肝炎的治疗包括保肝、抗纤维化、抗病毒、预防肝癌等方面，根据不同的病因，采取不同的治疗手段，为治疗慢性肝炎最重要的原则，治疗慢性肝炎患者的关键在如何消除肝脏炎症，使肝脏纤维化减轻[9]。现代医学在治疗慢性肝炎方面仍然不足：需要长期使用药物，成本高，用药不方便，临床应用受到一定的限制[10]。中医对慢性肝病是扶正祛邪，常用治法有清热解毒、化痰通络、疏肝理气、活血化瘀、软坚散结、益气养阴、健脾化湿、补肾柔肝、清热解毒、化湿解毒、活血解毒、扶正解毒等。

丹参，归心、肝经。丹参能改善微循环，活血化瘀，调整组织修复和再生，可以显著降低肝脏的脯氨酸含量，抑制成纤维细胞增殖和胶原在细胞内的合成，改善肝脏功能，具有多个目标综合抗纤维化的药理作用[11]。近几年研究显示，中药丹参制剂在慢性肝炎的治疗中研究较多，它具有保肝作用，能够有效改善肝组织坏死;可以改善肝脏微循环，具有抑制细胞纤维化的作用;丹参为良好的抗氧化剂，具有抑制星状细胞的增殖与活化，促进肝细胞的再生等作用[12-14]。

网络药理学（Network Pharmacology）是以系统生物学、药理学和计算机技术为基础，实现对药物作用的全面网络分析，特别适合以多成分、多靶点、多机制为特点的中药研究[15]。因此，本研究拟通过网络药理学方法提取丹參抗慢性肝炎潜在有效成分及其作用靶点，分析其作用机制，为丹参在慢性肝炎上临床应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php;GeneCards数据库https：//www.genecards.org/;Uniprot数据库http：//www.uniprot.org/;Pubchem数据库https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/;Pharm Mapper数据库http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html;Cytoscape（3.7.2）软件http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/;DAVID数据库https：//david.ncifcrf.gov/;String数据库平台https：//string-db.org/cgi/input.pl获取相关资料[16]。

1.2 丹参活性成分筛选及其靶点的获取

在TCMSP中预测丹参中化学成分的吸收、分布、代谢。本研究共收集了丹参中的202个化合物，并通过口服生物利用度（OB）、类药性（DL）和药物药代动力学筛选高活性化合物，其中，OB是指药物口服后被人体吸收进入血液循环的相对数量和速率;DL反映了化合物中特定官能团与已知药物的相似性，对评价中药化学成分的活性具有重要意义。查阅文献，取OB≥30%，DL≥0.18作为域值筛选高活性区的关键化合物[17]。

1.3 丹参有效成分靶点规范化

因丹参有效成分靶点来源不统一引起丹参靶点名称不规范，因此需要对筛选得到的靶蛋白和基因信息进行校正。将所获得的靶点在Uniport数据库中进行搜索，将物种设置为人，获得靶点标准的Uniport名称。

1.4 疾病靶点的获取与交集靶点的筛选

在GeneCards数据库输入关键词Chronic hepatitis获得慢性肝炎的蛋白靶点基因并与1.1筛选出的药物靶点进行韦恩分析，获取交集靶点。

1.5 中药-疾病-靶点交互网路建立

本研究将丹参和慢性肝炎的共同靶点与丹参中关键化合物使用Cytoscape3.7.2软件进行绘制网络图，以阐明丹参治疗慢性肝炎的机制。在这个网络图中，关键化合物和靶点以节点表示，节点之间相互作用的关系以边来表示。

1.6 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

考虑到靶标之间的相互作用，我们将89个靶标基因引入String数据库平台，得到PPI关系，并以“>0.9”的评分筛选PPI关系，隐藏离散点。下载PP网络图，筛选前30个核心基因。

1.7 基因本体（GO）富集分析

将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cell Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）富集[18]，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选。使用R 3.6.3软件，安装并引用clusterProfiler、enrichplot、ggplot2包，进行柱状图和气泡图绘制。

1.8 京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选。使用R 3.6.3，安装并引用clusterProfiler包后，进行柱状图和气泡图绘制。

2 结果

2.1 药物化学成分及药物靶点筛选

利用TCMSP筛选丹参中的202种已知成分，通过OB≥30%和DL≥0.18筛选出丹参中65种高活性关键化合物，包括丹参酮、紫杉醇、丹参醛、丹酚等。见表1。其中65种有效成分对应935相关靶点，有680个有效相关靶蛋白和109个靶基因。

2.2 疾病靶点

查询丹参中以上65个化合物的靶标信息，并通过Uniprot基因ID注释获取丹参的基因ID，在Genecard数据库中找到慢性肝炎相关靶点共8 046个，与丹参共有靶点89个。见表2。并用R3.6.3绘制维恩图。见图1。

2.3 活性成分-潜在靶点网络关系图

网络共涉及节点（Nodes）114个，其中红色为疾病，即慢性肝炎，蓝色部分为丹参高活性成分，紫色为丹参，黄色为疾病的预测靶点，边线表示化合物、靶点、药物、疾病之间存在相关性。通过插件cytoNCA按照度（Degree）、紧密度（Closeness）2种属性分别取排序靠前的成分或者靶点。成分有异隐丹参酮（Isocryptotanshi-none）、1，2，5，6-tetrahydrotanshinone、丹参醌新酮Ⅰ（MiltiononeⅠ）、二氢丹参内酯（Dihydrotanshinlactone）、4-methylenemiltirone、丹参酮Ⅱa（TanshinoneⅡa）、木犀草素等，靶点有ADRB2、OPRM1、PTGS1、CA2、PTGS2。见图2。

2.4 PPI网络构建

将潜在治疗靶点基因导入STRING数据库，物种选择人类，筛选评分>0.9的蛋白质相互作用关系，构建PPI网络。见图3。其中蓝线代表基因共同进化的证据，红线代表基因融合的证据，黄线代表文本挖掘的证据。完成PPI网络。见图4。该网络包含263条边，59个节点。其中，评分≥0.99的PPI蛋白为CDKN1A-CCND1、AKT1-NOS3、TP53-MDM2、NCOA2-AR、CDKN1A-CCNA2、CDKN1A-PCNA、AKT1-GSK3B、JUN-FOS、CDKN1A-TP53、EDN1-EDNRA、NCOA2-NR3C1、CCNA2-CCNB1、PTPN1-INSR、EGFR-STAT3、IL10-IL6、RXRA-NCOA2、IL10-TNF、IL6-STAT3、MYC-CDKN1A、IL6-IL4、AKT1-CDKN1A、ESR1-NCOA2、JUN-MAPK14、IL10-STAT3、VEGFA-STAT3、AKT1-STAT3、AKT1-CASP9、AKT1-TP53、VEGFA-NOS3、STAT3-CCND1、CDKN1A-CCNB1、TNF-NFKBIA、TNF-IL4、MYC-JUN、MYC-AKT1、JUN-TP53、AKT1-MDM2、AKT1-ESR1、CCNA2-TP53、ESR1-CCND1、GSK3B-CCND1、TP53-MAPK14、MYC-STAT3。RBl-CCNDl;ESR1-CCNDl;USK3B-CCNDl。通过计算每个基因节点数的连接，找到前30个核心PPI。见图4。即：STAT3、JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC、EDN1、ESR1、FOS、VEGFA、IL2、IL4、GSK3B、CASP3、EGFR、IL10、NR3C1、CCNA2、ERBB2、MMP9、NCOA2、NFKBIA、NOS2、NOS3、、PTPN1、AR。见图4。

2.5 GO富集分析结果

将药疾病共有靶点进行GO的生物过程（BP）、细胞组分（CC）富集、分子功能（MF），引用String数据库，将校正P≤0.05的项目进行筛选，总共富集到1 796条生物过程，130项与分子功能相关，73项与细胞组成相关，结果可视化绘制柱状图和气泡图。见图5。

2.6 KEGG通路富集

将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，将校正P值≤0.05的项目进行筛选，总共富集到88条信号通路，根据P值由小到大筛选排名前20的通路绘制柱状图和气泡图。见图6。经分析的得到乙型肝炎、IL-17信号通路、丙型肝炎、HIF-1信号通路、内分泌的阻力、T细胞受体信号通路、PI3K/AKT信号通路，这7条信号通路是治疗慢性肝炎的主要通路。

3 讨论

近年来越来越多的研究表明，治疗慢性肝炎的关键在如何消除肝脏炎症，肝脏纤维化。丹参可使肝细胞粗面内质网和线粒体具有显著的恢复和更新作用，显著增加肝细胞DNA和RNA含量，有利于肝细胞的修复和再生，从而抑制细胞内胶原的合成和肝纤维化。现已从丹参中分离得到丹参酮llA、丹参酮I、丹参酮、隐式丹参酮等脂溶性成分;丹酚酸等水溶性成分;木犀草素等黄酮类成分共100余种。本研究采用网络药理学方法，首先通过OB和DL筛选丹参的有效成分，通过与慢性肝炎相关的有效成分靶区预测丹参治疗慢性肝炎的有效成分。最终分析活性成分与疾病是受生物过程影响并参与信号通路的共同靶点。从信号通路的角度探讨丹参治疗慢性肝炎的可能机制。

通过PPI筛选发现STAT3、JUN、AKT1、TNF，TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC等是丹参治疗慢性肝炎的关键靶点。STAT3作为STAT家族的主要成员之一，是介导细胞间信号转导的经典转录因子，最初被发现是作为对IL-6等炎症介质的产生应答的关键胞内分子。正常情况下存在于细胞质中，被磷酸化Tyr705激活后调控基因的表达。研究发现STAT3介导分化、凋亡、免疫和炎症反应在内的多等种生物学过程，STAT3可与核因子κB交互作用，有助于核因子κB活化，上调多种炎症介质，而活化的核因子κB可产生白细胞介素-6（Interleukin 6，IL-6），进一步激活STAT3，上述正反馈过程，促进炎症发生发展。肝炎病毒感染可诱导肝细胞合成大量TNF，TNF也可诱导体内产生IL-6，二者关系密切。因此在肝组织中可以发现大量的炎症介质。这些炎症介质参与肝脏促炎症反应，肝细胞损伤，多种肝细胞分化和增殖，从而导致永久肝臟慢性炎症，并导致纤维化的形成。JUN是JNK的下游产物，当JNK被活化后，JUN磷酸化，JUN的激活依赖于转录的凋亡信号通路，肝细胞凋亡是导致肝损伤的一个重要机制，促进肝脏炎症及纤维化的发展，抑制JUN磷酸化可抑制细胞的凋亡与自噬，抑制肝脏炎症及纤维化的发展。MAPK14是丝裂原活化蛋白激酶14，可介导多种炎症介质的激活如TNF、IL-6等，促进肝细胞炎症的产生;同时MAPK14可磷酸化P53，是细胞周期阻滞在G1、G2期，诱导细胞凋亡，促进肝脏炎症的发展。TP5是细胞肿瘤抗原，通过调控DNA修复基因的转录等相关通路，达到抗炎、抗病毒、增强免疫力的作用。AKT1（蛋白激酶），在调控细胞成活和凋亡中有重要作用，激活AKT1可保护肝细胞，抑制肝脏受损。

依据GO富集分析结果可知，BP主要涉及活性氧代谢过程、循环系统血管功能、氧化应激反应、凋亡等。肝细胞凋亡是导致慢性肝炎的重要机制之一，丹参通过调控肝细胞凋亡过程，减轻肝损伤，抑制肝脏炎症的发展。乙醇代谢过程中产生的大量活性氧，氧自由基的毒性反应使人体发生氧化应激，是酒精性肝病发生发展的关键机制之一，丹参通过参与调控活性氧代谢过程和氧化应激反应，治疗慢性酒精性肝炎，调控涉及CCNA2、CCKN1、JUN等。肝内血管的炎症、破坏、阻塞及增生病变，引起肝供血障碍，这贯穿慢性肝炎发展的整个阶段。丹参通过调控循环系统血管功能，促进肝脏内皮细胞增殖、提高血管通透性从而达到治疗慢性肝炎的目的，调控涉及EGFR、AKT1、VEGFA等。

依据KEGG富集分析结果可知，在治疗过程中相关度较高的通路有乙型肝炎、IL-17信号通路、丙型肝炎、HIF-1信号通路、内分泌的阻力、T细胞受体信号通路、PI3K/AKT信号通路等。PI3K/AKT信号通路为生物体内重要的生存信号通路。在PI3K/AKT信号通路中，可介导AKT的活化，活化的AKT可促进肝损伤细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进慢性肝炎的发展，丹参可通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制AKT的活化，降低肝细胞损伤、氧化应激及凋亡，减轻肝炎症的发生。IL-17参与肝细胞损伤和炎症的发病机制，IL-17具有强的中性粒细胞募集和活化，可诱导T细胞活化，刺激成纤维细胞、上皮细胞和巨噬细胞生成IL-1、IL-6等多种炎症介质和化学激活素从而诱导炎症，丹参可直接介导IL-17信号通路，减轻其活性从而控制炎症的扩大化。T细胞受体（TCR）在T细胞的功能和免疫突触的形成中起着关键作用。它在T细胞和抗原呈递细胞（APC）之间提供连接。激活T淋巴细胞是免疫系统有效反应的关键事件。TCR的激活受多种共刺激受体调控。丹参激活TCRT通路，通过免疫反应直接杀死乙型肝炎和丙型肝炎病毒，抑制慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的发展。缺氧诱导因子1（HIF-1）是调节氧稳态的主要因子，HIF-1的靶基因编码增加氧气输送的蛋白质，并介导对缺氧的适应性反应。HIF-1不仅是由于氧利用率降低而引起的，而且是由其他刺激物（如一氧化氮）或各种生长因子引起的，丹参介导HIF-1信号通路，通过调控一系列缺氧相关基因的表达，增强肝细胞在低氧环境下的代谢适应能力，并参与肝病恶性转化的生物过程。

综上所述，丹参治疗慢性肝炎的作用机制可能是其有效成分通过STAT3、、JUN、AKT1、TNF，TP53、MAPK14、CCND1、CDKN1A、IL6、MYC等关键蛋白介导乙型肝炎、IL-17信号通路、丙型肝炎、HIF-1信号通路、内分泌的阻力、TCR信号通路、PI3K/AKT信号通路等协作产生凋亡、免疫杀伤、抑制炎症产生等直接作用以及增加肝细胞的低氧代谢能力来防治慢性肝炎。本研究揭示了丹参治疗慢性肝炎是多成分，多靶点，多生物过程的，体现了中医药治病的整体理念，为后期的临床应用奠定了理论基础。但网络药理学尚存在局限性，有待后期更多的基础及临床实验的进一步证实。

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