艾叶挥发性成分对膝骨关节病作用机制的网络药理学探讨

2021-11-29王春柳万兆新周洁刘洋张红李晔苏同生

世界中医药 2021年20期

王春柳万兆新周洁刘洋张红李晔苏同生

摘要目的：基于網络药理学方法探讨艾叶挥发性成分对膝骨关节病的作用机制。方法：基于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、DrugBank、TTD数据库分别建立艾叶挥发性成分-靶点网络和疾病靶点网络，基于Cytoscape 3.7.0软件建立艾叶挥发性成分-作用靶点网络并进行网络拓扑属性分析;利用DAVID数据库对核心作用靶点进行基因本体（GO）功能富集分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：构建的有效成分-作用靶点网络有40个有效成分、265个靶点。靶点互做分析得到的核心靶点生物功能注释分析，得到的核心BP过程包括类固醇代谢、胆汁酸和胆盐运输、氧化还原等;CC过程包括突触后膜、原生质膜组成、等离子体膜等;MF过程包括血红素结合、细胞外配体门控离子通道活性、类固醇羟化酶活性等。通路富集得到的核心KEGG通路包括神经配体受体交互作用通路、甾类激素生物合成、胆汁分泌等。网络分析得到重要的活性成分有龙脑、杜松樟脑、异泽兰黄素等。结论：艾叶挥发性成分对膝骨关节病的作用可能是基于调控神经配体受体交互作用通路、神经信号负传导Toll样受体信号等通路调理膝骨关节病。

关键词艾叶;网络药理学;挥发油;膝骨关节病;作用机制

Abstract Objective：The aim of this study was to investigate the mechanism of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy based on network pharmacology.Methods：The volatile component-target network and the disease target network of artemisia argyi were established respectively based on TCMSP，DrugBank and TTD databases.Core targets were enriched by DAVID database for gene ontology（GO） function and genome encyclopedia（KEGG） pathway.Results：The active component-action target network consisted of 40 active components and 265 targets.The annotation analysis of the biological function of the core target obtained by the analysis of the target interaction，the core BP process obtained included steroid metabolism，bile acid and bile salt transport，REDOX，inflammatory response，steroid hormone-mediated signaling pathway，etc.CC process included postsynaptic membrane，protoplasmic membrane composition，plasma membrane，organelle membrane，chlorine channel，etc.The MF process includes heme binding，extracellular ligand gated ion channel activity，steroid hydroxylase activity，iron ion binding，steroid binding，etc.The core KEGG pathways enriched by pathway include the neural ligand receptor interaction pathway，steroid hormone biosynthesis，bile secretion，cytochrome P450 metabolic response to exogenous drugs，negative neural signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，etc.The important active ingredients Predicted were borneol，juniper camphor，isoselanflavin，isoselanol，eugenol，eucalyptus olefine，spartanol，ter-turpentine，-pinene，-borneol acetate，cream-carytene，limonene，cur-elemene and cypreslidene.Conclusion：The effect of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy may be based on the regulation of the neural ligand receptor interaction pathway and the negative conduction of toll-like receptor signaling pathways.The pharmacodynamics may be closely related to borneol，juniper camphor，isoselanthin，isoselanol，eugenol and eucalyptus oil.

Keywords Moxa leaf; Network pharmacology; Volatile oil; Knee arthropathy; Pharmacological mechanism

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.003

膝骨关节病是因膝关节产生退行性改变导致关节内部功能发生障碍的一种慢性疾病，主要临床表现是膝关节疼痛、活动受限、关节僵硬等，且兼具病程长、病情复杂等特点，严重降低患者生命质量[1-2]。

艾叶是菊科植物艾（Artemisia argyi Levl.et Van）的干燥叶。辛、苦、温，归肝、脾、肾经，具有“温经止血、散寒止痛”的作用[3]。基于艾叶的温通散寒作用，艾灸一直是临床上治疗膝骨性关节炎的常用疗法，临床报道疗效良好，可明显改善膝骨性关節炎患者疼痛、僵硬、功能障碍等临床症状[4-6]。艾叶制剂如复方艾叶油乳膏也可减轻关节软骨的病理损伤，治疗膝关节骨关节炎的疗效显著。近年来，随着艾灸疗法的广泛应用，艾烟带来的环境污染和毒性问题也引起了普遍关注，长期高浓度的吸入艾烟对机体具有一定程度损伤作用[7-8]。由此，艾叶、艾灸的物质基础和作用机制研究成为了研究者们必须首先探究明确的问题之一。

网络药理学是中药学与计算科学、化学、药理学、药代动力学等多学科融合的一门交叉学科，其研究策略集化学成分-靶标-疾病-药理作用网络分析于一体，可以系统筛选中药治疗某一疾病的具体化学成分、可能作用靶点以及相关信号通路网络，从而揭示药物与靶标之间相互作用网络的特点[9-11]。近年来网络药理学在中药作用机制研究中逐渐发挥出越来越大的影响力。由此，本研究拟借助网络药理学方法分析艾叶挥发性成分对膝骨关节病作用机制，为艾叶在膝骨关节病中的临床应用推广和艾叶新型制剂开发奠定基础。

1 资料与方法

1.1 数据库采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;TTD数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）;DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）;ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）;DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）;STRING数据库（https：//string-db.org/，Version 10.5）;UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）;Cytoscape软件（Version 3.4.0）。

1.2 艾叶挥发性成分收集分别以艾叶挥发油为关键词，查找国家知识基础设施数据库（简称中国知网，China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、Web of Science数据库、TCMSP，收集艾叶挥发油化学成分报道[12-19]。

1.3 艾叶挥发性活性化合物筛选基于艾灸的用法，将艾灸视作经皮制剂处理，参考经皮制剂研究经验报道[20]，以1

1.4 艾叶活性成分靶点集构建利用TCMSP收集整理活性化合物作用靶点。

1.5 膝骨关节病靶点集构建通过TCMSP[10]、Drug bank数据库[11]、TTD数据库[21]、ETCM数据库[22]收集与膝关节病相关的作用靶点，将全部靶点信息导入UniProt数据库转换为Official Gene Symbol。

1.6 艾叶活性成分-作用靶点网络构建与分析利用STRING数据库，查找艾叶挥发油成分-靶点对应的直接蛋白互作及疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络关系，分别导入Cytoscape 3.7.0中，构建艾叶挥发油化学成分-靶点PPI和膝关节病靶点PPI，利用Cytospace的Merge功能对上述2个PPI网络进行合并，抽取交集网络，即得活性成分-作用靶点网络[23]。

1.7 基因功能富集分析与生物过程分析利用DAVID数据库对艾叶挥发油核心作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 活性化合物筛选通过检索中国知网数据库中关于艾叶挥发性成分的报道，收集整理共得到71种化合物，经过对ALog P指标筛选，最后有40种成分符合要求。见表1。

2.2 活性成分靶点集构建经TCMSP收集艾叶挥发性成分对应靶点，去重复后得到共计265个，由上述265个靶点组成靶点集合A。

2.3 膝骨关节病靶点集构建将TCMSP数据库、Drug bank数据库、TTD数据库、ETCM数据库所收集到的膝骨关节病相关靶点汇集整理，去重复后得到共计265个，组成疾病靶点集合B。

2.4 活性成分-作用靶点网络经过交集计算，发现活性成分-靶点集合A与疾病靶点集合B的交集C共有10个靶点，分别为：ABCG2、CD86、CYP1A2、ESRRA、IL6、NOS2、PIK3CG、PLA2G1B、PTGS2、TP53。

PPI网络经过Cytoscape 3.7.0可视化后见图1。网络拓扑分析可知活性成分-作用靶点网络共计包含371个节点、137 270条成分-靶点作用关系，每个靶点平均相邻靶点数目为28.943个，网络中心度为0.345，上述数据可知，该网络是个高度复杂、高密度网络。

为了能够进一步分析出上述网络中的核心靶点作用集，运用Cytoscape的MCODE工具，进行核心网络计算，设定自由度阈值为100，节点打分阈值为0.2，K值为2，最大深度为100，经计算得到2个最核心的子网络集合。见图2-A、图3-A。经过比较发现，子网络1中包含所有集合C中的靶点。子网络2中，有交集C中的TP53、IL6靶点也在其中。对2个子网络进行网络拓扑分析，发现子网络1包含346个节点119 370条对应关系，每个节点相邻靶点数目为24.012，网络中心度为0.456。子网络2包含10个节点，分别为AKT1、TP53、TNF、IL6、STAT3、IL1B、IL10、CXCL8、VEGFA、ALB，每个节点平均相邻靶点数为9个，网络中心度为1.0。说明上述10个靶点为关键的枢纽靶点。

归属出子网络1和子网络2中靶点对应的活性成分，建立活性成分-靶点映射网络分别见图2-B、图3-B。由图2-B可知，按照度值排序，子网络1对应活性成分前10位主要有：龙脑、异泽兰黄素、杜松樟脑、异龙脑、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龙脑酯，另外β-石竹烯、柠檬烯、γ-榄香烯、柏木烯等成分也同样属于网络核心节点，表明其活性与膝骨关节病相关。由图3-B可知，按照度值排序，子网络2对应活性成分前10位主要有：龙脑、杜松樟脑、异龙脑、α-松油烯、氧化石竹烯、α-松油烯、斯巴醇、桉油精、β-蒎烯、（-）-乙酸龙脑酯。

2.5 基因功能富集分析与生物过程分析将该核心网络中靶点列表导入DAVID进行功能富集分析，子网络1和子网络2的GO和KEGG分析结果分别见图4、图5。

由图4可知，按照P值排名，核心靶点子网络1中靶点主要参与生物过程（Biological Process，BP）前10位包括药物反应、类固醇代谢、胆汁酸和胆盐运输、氧化还原、异型生物质的代谢、P450酶、炎症反应、类固醇激素介导的信号通路、药物代谢;主要参与的细胞组分（Cellular Component，CC）涉及突触后膜、原生质膜组成、等离子体膜、细胞器膜、氯通道、细胞紧密连接、细胞表面性质、管基底等离子体膜;参与的分子功能（Molecular Function，MF）包括血红素结合、细胞外配体门控离子通道活性、类固醇羟化酶活性、铁离子结合、类固醇连接、氧化还原酶活性、供体受体配对、分子氧结合或还原、类固醇激素受体活性、药物连接、单氧酶活性等等。

核心靶点子网络2虽然包含靶点较少，依然涉及大量核心的生物过程，同样按照显著性P值排名，其参与的BP前10位包括凋亡过程负调控、RNA聚合酶Ⅱ啟动子转录的正调控、基因表达的正调控、序列特异性DNA结合转录因子活性的正向调控、炎症反应、细胞增殖的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、转录的正调控、DNA模板化、细胞对有机环化合物的反应、肽酰丝氨酸磷酸化的正调控等;主要参与的CC涉及细胞外区域、蛋白质复合体、血小板-阿尔法颗粒管腔、分泌颗粒、细胞质、核染色质等;参与的MF包括细胞因子活性、相同的蛋白结合、生长因子活性、转录调节区DNA结合、蛋白磷酸酶2A结合、蛋白结合、铜离子结合、蛋白磷酸酶绑定、伴侣蛋白绑定、转录激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录调控区序列特异性结合等。

由图5-A可知，核心靶点子网络1中靶点主要富集的通路过程（前10位）代表性的有汁分泌、细胞色素P450对外源性药物代谢反应、神经信号负传导神经配体受体交互作用通路、甾类激素生物合成、胆通路等;由图5-B可知，核心靶点子网络2主要富集的前10位代表性通路有类风湿性关节炎、Toll样受体信号通路等。

3 讨论

艾灸是中医学的瑰宝之一，守正创新，传承精华，开展艾灸作用机制研究是其重要内容之一。但是，艾灸疗法不同于传统的汤药等内服中药，其临床使用方式是用艾绒在体表的穴位上烧灼、温熨，借灸火的热力以及药物的作用，通过经络的传导，以起到温通气血、扶正祛邪，从而防治疾病。由于给药方式的特殊性，有关艾灸的药理研究尚待深入开展，因此，找到一种可靠方法能够为动物实验或临床试验开展指定方向，将具有重大的应用价值[6]。本研究首次基于网络药理学方法，对艾灸的典型临床应用—膝骨关节病中艾灸的作用机制进行了初步分析，也可为后续其他疾病中分析应用提供方法学参考借鉴。

《中华人民共和国药典》2015版本中对于艾叶的质量控制检查项还只有水分和总灰分2项，含量测定仅限于对桉油精单成分的测定。随着临床及家用艾灸需求的增加，对于艾叶的质量控制也将提出新的要求，艾叶中新的质控成分还需要继续挖掘。本研究从成分药理活性角度给出了龙脑、杜松樟脑、异泽兰黄素、异龙脑、丁香酚、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龙脑酯、β-石竹烯、柠檬烯、γ-榄香烯、柏木烯等成分作为潜在质控指标的依据，但还需要结合含量测定及艾叶整体指纹图谱等分析结果，作为研究新的艾叶质量控制标准的依据。

本研究采用网络药理学分析，发现艾叶挥发性成分可能是通过调控神经配体受体交互作用通路、甾类激素生物合成、胆汁分泌、细胞色素P450对外源性药物代谢反应、神经信号负传导Toll样受体信号通路等治疗膝骨关节病。药效作用与龙脑、杜松樟脑、异泽兰黄素、异龙脑、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龙脑酯、β-石竹烯、柠檬烯、γ-榄香烯、柏木烯等成分密切相关，本研究分析结果可为艾灸在膝骨关节病中临床应用提供理论依据，为后续进行艾灸治疗膝骨关节病作用机制和有效成分寻找及质量控制研究提供线索，具体机制还有待进一步的实验验证。

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