帕瑞昔布钠对老年大鼠术后中枢炎症反应、凋亡及认知功能的影响

刘 娜 徐悦利 武雅琦 彭俊旭 张 欣 林嘉欣 任从才▲

1.中山大学附属第八医院（深圳福田）麻醉科，广东深圳 518000；2.深圳市妇幼保健院麻醉科，广东深圳 518000

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）指患者在手术后数天或数月学习记忆或认知功能下降，好发于老年患者。但其发病机制仍不清楚[1-2]。环氧合酶（cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素（prostaglandin，PG）的关键酶，炎症介质环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）备受学者关注。研究显示，中枢神经系统退行性疾病发病机制与脑内小胶质细胞激活、COX-2 上调和损伤性PG 的合成增加，凋亡反应启动有关[3-4]。因此，本研究运用选择性COX-2 抑制剂帕瑞昔布钠（Parecoxib Sodium）干预老年大鼠POCD 模型，观察机体创伤后小胶质细胞激活状态、中枢炎症反应及细胞凋亡与POCD 的关系，探讨可能的病理基础，旨在为临床治疗POCD 奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究获中山大学附属第八医院实验动物伦理委员会批准后实施。选择40 只雄性老年SD 大鼠，体重（500±50）g，15～16 周龄，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK（京）2011-0009]。实验动物饲养于清洁级动物房，光照时间为8:00～18:00，室温为22～24℃，湿度为50%。

1.2 实验用药

帕瑞昔布钠（江苏辉瑞有限公司，批号CR3115）；戊巴比妥（Sigma 公司，USA，产品CAS57-33-0）

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

大鼠随机分为四组（n=10）：等时间点给予大鼠腹腔注射等体积0.9%NaCl 作为对照组；等时间点给予大鼠腹腔注射等剂量帕瑞昔布钠作为帕瑞昔布钠组；大鼠行左肾切除术作为模型组；大鼠行左肾切除术并于术前连续3 d 给予腹腔注射帕瑞昔布钠10 mg/（kg·d），左肾切除术后连续3 d 给予腹腔注射帕瑞昔布钠2 mg/（kg·d）作为治疗组。

1.3.2 动物模型制作

手术步骤参照文献[5]的方法。腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，手术步骤：无菌条件下左肋缘下，上腹部行切口约3 cm，游离左侧肾脏，丝线结扎两次肾动、静脉后切除左侧肾脏。

1.3.3 Morris 水迷宫实验

术前大鼠连续5 d 进行定位航行训练，即每天将大鼠从4 个不同入水点随机放入池中4 次，系统记录大鼠寻找到隐藏水下平台所用时间，即逃避潜伏期（escape latency）。具体包括以下两个方面。

1.3.3.1 空间探索实验 将原有训练平台撤掉，让大鼠在原平台所在象限对侧入水，测试60 s 内大鼠在目标象限停留时间、穿过原目标平台位置的次数（即穿台次数）。

1.3.3.2 工作记忆检测 随机将训练平台放于空间探索实验所在平台以外的任一个象限，大鼠入水后如60 s内爬上该平台并停留15 s，如没有找到该平台，可将其引导到平台停留15 s，间隔30 s 后从同一入水点入水，图像采集系统记录大鼠找到隐藏在水面下的平台潜伏期。

1.4 免疫荧光实验

术后第3 天完成水迷宫检测后，取一侧海马和前额皮层组织，另一侧海马组织，保存于-80℃冰箱。石蜡切片制作，抗原修复液修复后滴加小胶质细胞激活状态离子钙接头蛋白分子1（Iba1）（1∶100，美国Abcam 公司） 切片孵育，4℃冰箱过夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min，二抗anti-rat FITC（1:200）室温孵育2 h，PBS漂洗5 min，共3 次，切片经显色，复染，脱水，二甲苯透明，封片后采用共聚焦荧光显像系统（日本Olympus）观察并采集，每只大鼠切片随机取3 张（取5 个视野的平均值），Image pro-plus 6.0 图像软件分析，200倍镜检计数小胶质细胞阳性细胞数量。

1.5 细胞凋亡蛋白及活化型caspase3、COX-2 蛋白表达及前列腺素E2 含量测定

蛋白浓度测定采用二喹琳甲酸法。蛋白样本（50 μg） 在10% SDS-PAGE 胶上经电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉（5%）室温封闭2 h，分别用兔抗鼠COX-2、细胞凋亡蛋白caspase3、活化型caspase3（cleaved-caspase3）（1∶1000 倍稀释，美国Sigma 公司）一抗孵育，4℃摇床过夜，TBST 漂洗3 次，辣根过氧化酶标记的二抗孵育（1∶3000），室温摇床孵育1 h，洗膜3 次，ECL 显影剂显影并用Gel-pro analyzer 4.0 版软件分析灰度光密度值。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）含量的测定，严格按照试剂盒说明书进行操作步骤。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0 软件系统进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用重复测量方差分析，组间比较采用2×2 ANOVA 双因素方差分析联合Dunnett post hoc test 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义，以P＜0.01 为差异有高度统计学意义，以P＜0.001 为有极其显著的统计学差异。

2 结果

2.1 术后第3 天各组大鼠Morris 水迷宫实验结果的比较

定位航行训练结果显示，空间探索实验中，各组间大鼠的游泳速度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1，图1）；术后第3 天，治疗组大鼠在目标象限停留时间长于模型组，模型组大鼠在目标象限停留时间短于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图2）；术后第3 天，治疗组大鼠在目标象限穿台次数多于模型组，模型组大鼠在目标象限穿台次数少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图3）；术后第3天，工作记忆测试实验中，治疗组大鼠在登台的潜伏期短于模型组，模型组大鼠在登台的潜伏期长于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图4）。

表1 术后第3 天各组大鼠Morris 水迷宫实验结果的比较（±s）

表1 术后第3 天各组大鼠Morris 水迷宫实验结果的比较（±s）

与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

对照组帕瑞昔布钠组模型组治疗组10 10 10 10 183.56±20.81 178.79±22.71 170.90±22.47 178.79±22.71 19.11±1.83 18.78±1.88 17.49±1.51a 19.06±1.45b 2.45±0.92 2.50±0.87 1.70±0.73a 2.45±0.82b 20.21±2.44 20.67±2.48 22.65±2.77a 20.51±2.50b组别 数目 游泳速度（mm/s）目标象限停留时间（s）穿台次数（次）登台的潜伏期（s）

图2 各组大鼠在Morris 水迷宫实验中目标象限停留时间的比较

图3 各组大鼠在Morris 水迷宫实验中穿台次数的比较

图4 各组大鼠在Morris 水迷宫实验中登台潜伏期的比较

2.2 术后第3 天各组大鼠免疫荧光染色Iba1 蛋白标记脑内阳性小胶质细胞计数的比较

术后第3 天，模型组大鼠的海马CA1 区和前额皮层区脑内小胶质细胞Iab1 蛋白标记阳性细胞数高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）（表2，图5～7），与对照组比较，模型组的小胶质细胞状态显著激活。

图5 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区小胶质细胞Iba1 蛋白免疫荧光标记图（见内文第30 页）

术后第3 天，治疗组大鼠的海马CA1 区和前额皮层区脑内小胶质细胞Iab1 蛋白标记阳性细胞数低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）[表2，图5（封三），图6（封四），图7～8]，与模型组比较，治疗组给药显著减弱手术诱发的老年大鼠术后小胶质细胞激活状态。

表2 术后第3 天各组大鼠免疫荧光染色Iba1 蛋白标记脑内阳性小胶质细胞计数的比较（个，±s）

表2 术后第3 天各组大鼠免疫荧光染色Iba1 蛋白标记脑内阳性小胶质细胞计数的比较（个，±s）

与对照组比较，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；与模型组比较，bP＜0.05

对照组帕瑞昔布钠组模型组治疗组10 10 10 10 186.76±23.35 188.12±18.05 209.78±13.42aa 191.38±20.54b 125.51±17.61 129.85±17.22 164.09±19.91aaa 148.37±19.62b组别 数目 海马CA1 区细胞 前额皮层区细胞

图7 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区Iba1 蛋白标记阳性小胶质细胞计数免疫荧光染色的比较

图8 术后第3 天各组大鼠前额皮层区Iba1 蛋白标记阳性小胶质细胞计数免疫荧光染色的比较

2.3 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比较

术后第3 天，模型组大鼠海马CA1 区COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）（表3，图9～13）。

表3 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比较（±s）

与对照组比较，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；与模型组比较，bP＜0.05

对照组帕瑞昔布钠组模型组治疗组10 10 10 10 0.98±0.19 0.91±0.17 1.29±0.15aa 1.06±0.13b 0.13±0.06 0.12±0.05 0.19±0.06aaa 0.14±0.03b 228.68±51.48 233.35±55.21 297.58±64.47aa 248.17±40.60b组别 数目 COX-2/β-actin cleaved-caspase3/caspase3 PGE2（pg/ml）

术后第3 天，治疗组大鼠海马CA1 区COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2，图9～13），与模型组比较，治疗组明显改善手术创伤触发的术后第3 天大鼠海马CA1 区COX-2 蛋白水平高表达、其产物PGE2含量的增加及cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达量比值的增高。

图9 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区COX-2 蛋白及相应内参蛋白条带

图10 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区COX-2/β-actin 比值变化的比较

图11 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区PGE2 含量变化的比较

图12 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区cleaved-caspase3、caspase3 蛋白条带及相应内参蛋白条带

图13 术后第3 天各组大鼠海马CA1 区cleaved-caspase3/caspase3 比值变化的比较

3 讨论

与海马功能密切相关的Morris 水迷宫实验是评价啮齿类动物空间学习记忆能力的经典实验[6]，其观察指标是动物发现隐匿平台的时间（即潜伏期）和空间探索实验时的穿台次数和目标象限停留时间。本研究结果显示，术后第3 天，模型组大鼠在工作记忆测试实验中登台的潜伏期长于对照组，在目标象限停留时间短于对照组，在目标象限穿台次数少于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示手术创伤诱导大鼠术后学习记忆能力减弱，认知功能下降。有研究证实，在术后3 天老年大鼠空间学习记忆能力下降，逐渐恢复[7]，An 等[8]也发现了同样的实验结果。本研究结果与以上研究[7-8]发现一致，且本研究实验结果恰好说明了POCD 是可逆的。本研究结果还显示，术后第3天，治疗组大鼠在目标象限停留时间长于模型组，在目标象限穿台次数多于模型组，在工作记忆测试实验中登台的潜伏期短于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示帕瑞昔布钠可改善大鼠的学习记忆功能。本研究结果显示，空间探索实验中，各组间大鼠的游泳速度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明大鼠自身活动能力及注射药物等非相关因素未影响上述行为学测试结果。

研究表明，POCD 的发生发展过程与中枢神经系统炎症反应关系密切，手术应激创伤引起的机体炎症反应是围术期重要的病理生理学改变[9]。小胶质细胞是中枢神经系统内主要的巨噬细胞，呈静息状态，病理状态下被激活的小胶质细胞释放多种炎症因子及氧自由基，启动凋亡反应导致中枢神经系统损伤。临床上，帕瑞昔布钠是一种选择性COX-2 抑制剂，发挥抗炎与解热镇痛双重作用[10]。文献报道，COX-2 选择性抑制剂在中枢神经系统相关性疾病中发挥神经保护作用[11-13]。美洛昔康降低AD 小鼠模型的脑内氧化应激反应，改善记忆与认知功能的下降[11]。同样，美洛昔康抑制小鼠脾切除术后脑内星型胶质细胞的激活，改善学习记忆功能的降低[12]。脑缺血模型大鼠中，帕瑞昔布钠能降低大鼠脑内氧化应激反应程度及神经元细胞的凋亡，改善脑缺血后的脑损伤[13]。帕瑞昔布钠还能降低老年人POCD 的发生率[14]。因此，本研究选取帕瑞昔布钠为研究药物，研究中帕瑞昔布钠的使用剂量参考文献[15]。

本研究结果显示，术后第3 天模型组脑内小胶质细胞被激活，Iab1 蛋白标记小胶质细胞阳性细胞数高于对照组，同时COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01），说明手术创伤导致短暂的老年大鼠中枢神经系统小胶质细胞激活，引起炎症因子释放，降低动物认知功能。Wan 等[16]证实，大鼠术后中枢神经胶质细胞显著激活，炎症介质及凋亡因子水平明显增加，导致大鼠认知功能障碍，与本实验结果相似。本研究结果显示，术后第3 天，治疗组大鼠的海马CA1 区和前额皮层区脑内小胶质细胞Iab1 蛋白标记阳性细胞数低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第3 天，治疗组大鼠海马CA1 区COX-2/β-actin及PGE2含量低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示帕瑞昔布钠抑制手术创伤诱发的小胶质细胞激活及COX-2、PGE2等炎症因子的释放。该实验结果与前期评价认知功能的行为学检测结果是一致的，即模型组大鼠学习记忆能力的降低伴随着大鼠脑内小胶质细胞的激活，炎症介质释放与凋亡反应启动，而治疗组大鼠学习记忆能力的改善与小胶质细胞的免疫反应激活程度减轻、炎症介质释放减少与减弱凋亡反应有关。

认知损伤的过程与细胞凋亡密切相关[17]。本研究结果显示，模型组大鼠cleaved caspase-3/caspase-3水平高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；治疗组大鼠cleaved caspase-3/caspase-3 水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。分析推断帕瑞昔布钠的神经保护效应与抑制中枢炎症反应和细胞凋亡均有关。

综上所述，手术创伤引起老年大鼠短暂性认知功能下降，伴随着小胶质细胞激活，炎症因子水平升高，细胞凋亡反应启动。然而，帕瑞昔布钠通过减弱海马神经组织炎症反应、凋亡等进程而改善认知功能。尽管确切的机制仍需进一步探讨，帕瑞昔布钠可能为预防POCD 提供了新的方向。