高效液相色谱法测定磷脂复合物中硫酸特布他林的含量

李蔷薇,雷 莹,刘 婧,李 维*,李 强

(1.成都大学 药学院 四川抗菌素工业研究所 抗生素研究与再评价四川省重点实验室,成都 610052;2.国药集团川抗制药有限公司,成都 610052)

硫酸特布他林,化学名为[(叔丁氨基)甲基]-3,5-二羟基苯甲醇硫酸盐(2∶1),又名博利康尼,其结构式见图1。硫酸特布他林为白色或类白色结晶性粉末,无臭,或微有乙酸味,遇光逐渐变色,在水中易溶,在甲醇中微溶,在三氯甲烷中几乎不溶[1]。硫酸特布他林对肾上腺素β2受体具有高度选择性,适用于支气管哮喘、慢性支气管炎、肺气肿和其他伴有支气管痉挛的肺部疾病的治疗,在国内外已得到广泛的应用[2]。

硫酸特布他林目前常见的剂型是雾化液和片剂,但其生物利用度较低。本课题组前期采用硫酸特布他林原料和大豆磷脂制备了一种生物利用度较高的磷脂复合物,该复合物可增加药物分子的亲脂性,促进药物吸收,从而提高了磷酸特布他林的生物利用度。

目前,磷酸特布他林的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[1-7]和紫外-可见分光光度法(UVVis)[8]。UV-Vis简单快捷,但选择性和灵敏度较差,不能将硫酸特布他林与大豆磷脂及其他物质有效分离,具有一定的局限性;HPLC选择性和灵敏度高,可将硫酸特布他林与大豆磷脂及其他物质较好地分离,并测定其含量[8]。本工作在前期制备好的硫酸特布他林磷脂复合物的基础上,参考《中华人民共和国药典》2020年版,通过优化色谱条件,建立了HPLC测定磷脂复合物中硫酸特布他林含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪,配紫外吸收检测器;UV-2450型紫外-可见分光光度计;XSE105 Dual-Range型电子天平;FE28型p H计;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器;Rotavapor R-114型旋转蒸发仪。

辛烷磺酸钠溶液:6.5 mmol·L－1,称取辛烷磺酸钠1.522 9 g,用水溶解并定容至1 L容量瓶中,配制成浓度为6.5 mmol·L－1的辛烷磺酸钠溶液。

硫酸特布他林对照品储备溶液:1.042 9 g·L－1,称取硫酸特布他林对照品10.429 mg,加入1 mL水溶解,再用体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液(p H 3.4)定容至10 mL容量瓶中,摇匀,避光保存。

硫酸特布他林对照品溶液:104.3 mg·L－1,移取1 mL硫酸特布他林对照品储备溶液于10 mL容量瓶中,用体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液(p H 3.4)稀释至刻度,摇匀,避光保存。

大豆磷脂溶液:2.0 g·L－1,称取大豆磷脂200 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液(p H 3.4)稀释至刻度,摇匀,避光保存。

硫酸特布他林对照品溶液系列:分别移取0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 mL硫酸特布他林对照品储备溶液,用体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液(p H 3.4)稀释,并定容至100 mL容量瓶中,配制成质量浓度为 5.2,10.4,26.1,52.1,104.3,260.7,521.4 mg·L－1的硫酸特布他林对照品溶液系列。

硫酸特布他林对照品的质量分数为99.8%;硫酸特布他林原料的纯度为99.2%;辛烷磺酸钠为分析纯;乙腈、甲醇为色谱纯;大豆磷脂为化学纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

AQUASIL®-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温30℃;流量1.0 mL·min－1;进样量20μL;流动相为体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛 烷 磺 酸 钠 溶 液 的 混 合 液(p H 3.4),等度洗脱;检测波长280 nm。

1.3 试验方法

称取自制的硫酸特布他林磷脂复合物210 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,摇匀,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用体积比为35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液(p H 3.4)稀释至刻度,摇匀,避光保存,得到硫酸特布他林供试品溶液,按照仪器工作条件进行测定[4-10],外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用紫外-可见分光光度计,在检测波长190～400 nm内对硫酸特布他林对照品溶液、硫酸特布他林供试品溶液和大豆磷脂溶液进行扫描,以确定硫酸特布他林磷脂复合物的最大吸收波长,结果见图2。

图2 紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

由图2可知,大豆磷脂溶液在210～220 nm内有干扰,并且211 nm附近属于末端吸收,容易产生杂峰;硫酸特布他林对照品溶液和硫酸特布他林供试品溶液在280 nm处均有紫外吸收,而大豆磷脂溶液在280 nm处无紫外吸收,因此试验选择检测波长为280 nm。

2.2 流动相的选择

当流动相p H大于4.4时,目标物开始出现肩峰,可能是硫酸特布他林在碱性条件下被氧化所致;当流动相p H调整至3.4时,目标物的肩峰消失。因此,试验选择流动相p H为3.4。

由于流动相的酸度与辛烷磺酸钠浓度的变化对磷酸特布他林保留时间的影响较小,而乙腈用量变化1%则会引起硫酸特布他林保留时间变化约10%[3],进而影响硫酸特布他林与大豆磷脂的分离,因此在流动相p H 3.4条件下,试验考察了不同体积比(10∶90,15∶85,20∶80,25∶75,30∶70,35∶65)的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液对硫酸特布他林分离效果的影响。结果显示,当乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸钠溶液的混合液体积比为35∶65时,硫酸特布他林的峰形较好,与大豆磷脂的分离度较高,因此试验选择流动相体积比为35∶65。

2.3 专属性试验

按照仪器工作条件对硫酸特布他林供试品溶液、硫酸特布他林对照品溶液、大豆磷脂溶液和流动相进行测定,所得色谱图见图3。

图3 专属性试验结果Fig.3 Results of specificity test

由图3可知,大豆磷脂溶液和流动相对硫酸特布他林色谱峰均无干扰,说明该方法的专属性较好。大豆磷脂和硫酸特布他林的保留时间分别为3.150,5.798 min,分离度为4.6,硫酸特布他林的峰形较好,理论塔板数大于3 000。

2.4 标准曲线与检出限

按照仪器工作条件对硫酸特布他林对照品溶液系列进行测定,以硫酸特布他林的质量为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,硫酸特布他林的质量在0.104 3～10.429 0μg内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程为y＝392.6 x,相关系数为0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果得硫酸特布他林的检出限为1.565 9 ng,测定下限为5.219 7 ng。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对质量浓度为104.3 mg·L－1的硫酸特布他林对照品溶液连续测定5次,计算得峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.18%,表明该方法精密度良好。

配制3个浓度水平的硫酸特布他林供试品加标溶液,并将其稀释至线性范围内,按仪器工作条件进行测定,计算回收率,结果见表1。

2.6 重复性和稳定性试验

按照仪器工作条件对硫酸特布他林供试品溶液重复测定5次,记录色谱峰,计算峰面积的RSD。结果显示,峰面积RSD为0.91%,表明本方法重复性良好。

按照仪器工作条件对放置0,1,2,4,24 h的硫酸特布他林对照品溶液和供试品溶液进行测定。结果表明,24 h内硫酸特布他林对照品溶液和硫酸特布他林磷供试品溶液的峰面积RSD分别为0.52%,1.27%,说明上述两种溶液在24 h内均较稳定。

2.7 耐用性试验

采用UltiMate 3000型高效液相色谱仪(配VWD-3100型紫外检测器)和PLATISILTMODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)对硫酸特布他林供试品溶液进行测定,结果见图4。

结果显示,在该系统下大豆磷脂和硫酸特布他林的保留时间分别为2.891,5.110 min,分离度为4.8,与本试验分离度无明显差别,并且硫酸特布他林的峰形较好,理论塔板数大于3 000,表明方法耐用,可靠性高。

2.8 样品分析

按照试验方法对自制的3种硫酸特布他林磷脂复合物SPC-1、SPC-2、SPC-3进行测定,根据公式(复合率＝硫酸特布他林的测定值/硫酸特布他林原料的投料量×100%)计算样品的复合率,结果见表2。

复合率是反映母体药物(硫酸特布他林)与大豆磷脂结合率的指标,一般复合率越高说明药物与大豆磷脂结合越多,游离药物越少。由表2可知,自制的3种硫酸特布他林磷脂复合物的复合率均较好。

本工作建立了HPLC测定自制硫酸特布他林磷脂复合物中硫酸特布他林含量的方法。该方法分离度好、回收率高、检出限低,可高效、准确地实现对硫酸特布他林磷脂复合物中硫酸特布他林的测定,为硫酸特布他林磷脂复合物的质量控制提供了一定的参考。