超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定复配消毒产品中聚六亚甲基双胍的含量

黄 芳,邓 欣,谢淑桐,谢梦婷,徐翠芳,罗辉泰,黄晓兰,吴惠勤

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心),广东省中药质量安全工程技术研究中心,广州 510070)

自新型冠状病毒肺炎爆发以来,消毒剂已成为抗疫必需品,由于日常消毒的需要引发人们对消毒剂的大量需求,市面上出现的消毒剂种类越来越多。不同消毒剂的性质不同,使用的对象、效果和方法也不尽相同。聚六亚甲基双胍,又称聚胺丙基双胍,是一种新型环保的胍类消毒剂,通常以盐酸盐的形式存在,其结构见图1。

图1 聚六亚甲基双胍盐酸盐的结构式Fig.1 Structural formula of polyhexamethylene biguanide hydrochloride

聚六亚甲基双胍具有极强的杀菌和抑菌性能,广谱高效、有效期长,分解温度超过400℃,自然环境下可降解,无毒副作用,使用安全[1],且具有速效、对皮肤黏膜无刺激性、对金属和织物无腐蚀性、稳定性好等特点[2],适用于手消毒、外科洗手消毒、手术部位皮肤及黏膜消毒,也可用于物体表面的消毒杀菌,是目前杀菌活性较好的消毒剂原料之一[3],还可作为畜牧养殖场消毒剂、织物表面处理剂、污水处理絮凝剂以及聚合物抗菌改性剂等。

聚六亚甲基双胍在不同消毒剂中的质量分数为0.001%～0.2%[4],而此类产品质量控制的分析方法却相对滞后。国家标准GB 26367－2010《胍类消毒剂卫生标准》只是针对原料的质量进行分析。文献[5-7]以GB 26367－2010中的分光光度法(质量分数为19.0%～21.0%)为标准;有些企业以固含量(≥20%)指标来控制原料的质量。而实际应用中对于复配的消毒产品,采用分光光度法测定专属性较差,容易产生干扰,导致结果不准确;同时聚六亚甲基双胍不是单体化合物,高效液相色谱法或液相色谱法[4-10]只是测定了一定色谱条件下能出峰且有紫外吸收的部分。实际检测中发现,不同厂家的消毒产品中聚六亚甲基双胍的聚合度不同,导致产品的相对分子质量分布有差异,造成测定结果不一致。本工作将不同聚合度的聚六亚甲基双胍盐酸盐水解成六亚甲基胍单体后,采用高分辨质谱法提取特征离子用于定量。该方法灵敏度高,避免了因原料聚合度不同导致的测定结果差异,为消毒产品的质量控制提供了技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型超高效液相色谱-6540型四极杆飞行时间质谱联用仪;KQ2200型台式机械超声波清洗器;H H-ZK2型恒温水浴锅;TP-114型电子天平;MS3 Basic型涡旋混合器;Milli-Q型纯化系统。

聚六亚甲基双胍标准储备溶液:1 g·L－1,称取聚六亚甲基双胍盐酸盐标准品10 mg,用水溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成质量浓度为1 g·L－1的标准储备溶液,于4℃避光保存。

聚六亚甲基双胍盐酸盐标准品的纯度为98.4%;甲醇、甲酸、乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯;试验用水为三级水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Poroshell EC120型色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.7μm);柱 温 30 ℃;流 量 0.3 mL·min－1;流动相A为乙腈,B为0.1%(体积分数)甲酸溶液;进样量2μL。梯度洗脱程序:0～6 min时,A为10%;6～8 min时,A为100%;8～12 min时,A为10%。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子模式采集;干燥气为氮气,干燥气温度300℃,干燥气流量8 L·min－1;雾化气为氮气,压力275.8 kPa;鞘气温度340℃,鞘气流量11 L·min－1;毛细管电压4 000 V,毛细管出口电压135 V,锥孔电压65 V,八极杆电压750 V;全扫描模式采集,扫描范围质荷比(m/z)70～1 200;参比离子为正离子m/z 121.050 9,922.009 8。

1.3 试验方法

取消毒剂样品2 mL于10 mL具塞试管中,加入4.0 mol·L－1盐酸溶液2 mL,于95℃水浴中水解2.0 h,取出,放冷至室温,用2 mol·L－1氢氧化钠溶液调节溶液酸度至弱酸性(p H 5～6),用水稀释至刻度,经0.45μm滤膜过滤得到样品溶液,按照仪器工作条件进行测定,采用提取离子外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 测定方法的选择

聚六亚甲基双胍的相对分子质量和水溶性是保证其杀菌效果的重要条件[1],文献[11]报道其相对分子质量在800～1 300 Da内具有较好的杀菌活性。但是目前还没有一种合适的方法能测定这类化合物的相对分子质量和含量,更没有统一的标准和方法来评价不同厂家聚六亚甲基双胍盐酸盐的质量。

文献[5-7]报道采用分光光度法测定聚六亚甲基双胍,其原理是直接测定234 nm处的吸光度,或用曙红(Eosin染料)显色反应后于545 nm处测定。而实际大多数消毒产品均由乳化剂、稳定剂以及其他功能剂或辅料复配而成,采用分光光度法得到样品溶液的颜色与对照品的颜色相差甚远,导致结果误差大,难以准确定量。

试验采用高效液相色谱法和凝胶色谱法测定不同来源聚六亚甲基双胍盐酸盐中聚六亚甲基双胍的含量,所得色谱图见图2。

图2 不同测定方法得到的色谱图Fig.2 Chromatograms obtained by different determination methods

由图2(a)可知,5个不同来源的聚六亚甲基双胍盐酸盐在同一色谱条件下出峰不一致,得到的不是单一色谱峰,可能是由于合成工艺[12-14]不同,得到的聚六亚甲基双胍聚合程度不同。若采用该方法进行定量,则需要用与样品一样的原材料作对照品,并选择其中保留时间一致的色谱峰。

凝胶色谱法根据物质的保留时间计算相对分子质量大小,保留时间短的物质相对分子质量相对较大。由图2(b)可知:A厂家的聚六亚甲基双胍盐酸盐相对分子质量较小,E厂家的聚六亚甲基双胍盐酸盐相对分子质量较大,且相对分子质量分布与标准品C基本一致;B厂家的聚六亚甲基双胍盐酸盐相对分子质量居中,相对分子质量分布与标准品D基本一致。根据文献报道,聚六亚甲基双胍的相对分子质量为1 000～1 800 Da,采用核磁共振法测试,推测该聚合物可能以大环化合物的形式存在[15]。由此可见,采用高效液相色谱法和凝胶色谱法对不同相对分子质量的聚六亚甲基双胍定量是不合适的。

试验进一步采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF-MS)直接进样测试,扫描范围m/z 70～3 200。结果显示,未得到m/z 800以上的分子或离子,因此采用UHPLC-Q-TOFMS直接进样测定聚六亚甲基双胍的含量也不合适。

综上分析,分光光度法、高效液相色谱法、凝胶色谱法、UHPLC-Q-TOF-MS均无法直接测定聚六亚甲基双胍的含量。因此,试验先用盐酸将产品中的聚六亚甲基双胍盐酸盐水解,再用UHPLC-QTOF-MS对水解单体进行测定。

2.2 水解条件的选择

按照试验方法提取离子m/z 184.1559峰面积为指标,考察了盐酸溶液浓度(2.0,4.0,8.0 mol·L－1)和水解时间(0.5,1.0,2.0,3.0 h)对聚六亚甲基双胍峰面积的影响,结果见图3。

图3 盐酸溶液浓度和水解时间对聚六亚甲基双胍峰面积的影响Fig.3 Effect of hydrochloric acid solution concentration and hydrolysis time on peak area of polyhexamethylene biguanide

由图3可知:当盐酸溶液浓度为2.0,4.0 mol·L－1时,随着水解时间的延长,水解产物的峰面积逐渐增大;当水解时间为2.0 h时,峰面积趋于平稳;并且当盐酸溶液浓度为4.0 mol·L－1时,水解产物的峰面积更大。综合考虑,试验最终选择水解时间为2.0 h,盐酸溶液浓度为4.0 mol·L－1。

2.3 定量离子的选择

按照试验方法将聚六亚甲基双胍标准溶液水解后上机分析,得到高分辨质谱图见图4。

由图4可知,丰度最高的特征离子为m/z 184.155 9,经仪器自带软件 Aglient Qualitative Navigator B.08.00推测,其分子式为C8H17N5;再根据二级碎片,推测其结构式为[(CH2)6－NHCNH－NH－CNH－NH]＋,即聚六亚甲基双胍的基本组成单元;进一步根据母离子及二级碎片推测并解析其余离子,各水解产物的质谱信息见表1。其中,A代表NH－(CH2)6－NH－CNH,B代表NH－(CH2)6－NH－CNH－NH－CNH。

表1 水解产物的质谱信息Tab.1 MS information of hydrolyzed products

图4 标准溶液的高分辨质谱图Fig.4 High resolution mass spectrum of standard solution

由表1可知:聚六亚甲基双胍盐酸盐水解后得到8个特征离子,测定值与理论值的相对误差的绝对值均小于2.00×10－6,表明测定值与理论值基本一致。以丰度最高的特征离子(m/z 184.155 9)为指标,提取离子峰面积,用于外标法定量。聚六亚甲基双胍标准溶液和实际样品溶液的提取离子流色谱图见图5。

图5 提取离子流色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms

2.4 标准曲线和检出限

移取适量的聚六亚甲基双胍标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度为1.0,2.5,5.0,10.0,50.0,100.0 mg·L－1的聚六亚甲基双胍标准溶液系列。按照试验方法进行测定,以聚六亚甲基双胍的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:聚六亚甲基双胍的质量浓度在1.0～100.0 mg·L－1内与其峰面积呈线性关系,线性回归方程为y＝348.5 x＋202.3,相关系数为0.994 6。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得检出限为1.0 mg·L－1。按照1.3节处理样品后测试,得到检出限为5.0 mg·L－1。

2.5 精密度和回收试验

对空白消毒剂样品进行低(1.16 mg·L－1)、中(11.6 mg·L－1)、高(58.0 mg·L－1)等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平取6份,按照试验方法处理并测定聚六亚甲基双胍的含量,计算回收率及测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明:聚六亚甲基双胍的回收率依次为112%,117%,99.5%,测定值的 RSD(n＝6)依次为8.1%,7.2%,7.7%。

2.6 样品分析

按照试验方法,测定了不同厂家送检产品中聚六亚甲基双胍的含量,结果见表2。

表2 样品分析结果Tab.2 Analytical results of samples %

结果表明,所送检产品中聚六亚甲基双胍的质量分数为0.032%～0.110%。

聚六亚甲基双胍应用广泛,但是相应的质量控制标准及方法相对滞后。由于不同来源的聚六亚甲基双胍在紫外吸收、相对分子质量分布、液相色谱行为等方面存在差异,因此本工作先将复配消毒产品中的聚六亚甲基双胍盐酸盐水解,建立了UHPLCQ-TOF-MS测定复配消毒产品中聚六亚甲基双胍含量的方法,可为此类产品的质量控制提供有效的技术支撑。