高效液相色谱法测定烟草中烟碱含量

2021-11-29钱建瑞杨清山张晓芳程远欣

理化检验-化学分册 2021年10期

钱建瑞,杨清山,,栗星,张晓芳,程远欣*

(1.晨光生物科技集团股份有限公司,邯郸 057250; 2.河北晨光检测技术服务有限公司,邯郸 057250)

烟碱,又称尼古丁,是烟草和卷烟的主要成分之一,也是衡量烟草和卷烟质量水平的一个重要指标,直接影响吸食者的生理满足程度和健康,因此准确测定烟碱的含量具有重要意义。烟碱的测定方法有紫外分光光度法[1]、络合分光光度法[2]、液相色谱法[2-8]、液相色谱-串联质谱法[2]、气相色谱法[2,9-11]、气相色谱-串联质谱法[2,12]、毛细管电泳法[2]、电化学法[2]等。分光光度法操作简单,但准确度较低;色谱-质谱法检测灵敏度和稳定性较好,但设备价格昂贵,不适合在行业内推广。

目前,烟草行业标准YC/T 246－2008《烟草及烟草制品烟碱的测定气相色谱法》,国家标准GB/T 23355－2009《卷烟总粒相物中烟碱的测定气相色谱法》以及GB/T 23225－2008《烟草及烟草制品总植物碱的测定光度法》中测定烟碱含量的方法主要存在两方面的问题:一是前处理过程(包括振荡、液液萃取、浓缩、复溶)繁琐,且操作耗时长;二是测定结果的误差较大。为降低测定结果的误差,提高分析效率,实现对烟草中烟碱快速准确测定,本工作采用超声提取法,建立了高效液相色谱法(HPLC)测定烟草中烟碱含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Alliance E2695型高效液相色谱仪,配紫外检测器;KQ-400B型超声波清洗仪;HY-4型多功能振荡器;FW-100型万能粉碎机。

烟碱标准储备溶液:称取烟碱标准物质20 mg(精确至0.01 mg),用甲醇稀释并定容至25 mL容量瓶中,充分摇匀,配制成质量浓度为800 mg·L－1的烟碱标准储备溶液。

含0.2%(体积分数,下同)三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸盐缓冲液:称取2.20 g磷酸二氢钠和1.07 g磷酸氢二钠,加入1 L水和2 mL三乙胺,摇匀,用磷酸调节溶液p H至6.0,用0.22μm滤膜过滤,滤液经超声脱气后备用。

烟碱标准物质的纯度不小于99%;甲醇为色谱纯;磷酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、三乙胺均为优级纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Kromasil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm,5μm);柱温40℃;环境温度20～26℃;流动相为体积比 40∶60 的甲醇-含 0.2% 三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸盐缓冲液(p H 6.0)的混合液;流量1.0 mL· min－1;进样量 10μL;检测波长259 nm。

1.3 试验方法

将样品粉碎后过40目(孔径0.425 mm)筛网,称取粉碎后的样品0.5 g(精确到0.1 mg),用含0.1 mol·L－1氢氧化钠的75%(体积分数,下同)甲醇溶液溶解并定容至100 mL,超声提取30 min,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照试验方法对烟草样品进行测定,所得色谱图见图1。

图1 烟草样品色谱图Fig.1 Chromatogram of tobacco sample

2.2 提取方法和提取时间的选择

以实际烟草样品(烟碱参考值为19.1 mg·g－1)为研究对象,考察了不同提取方法(索氏提取[6]、超声提取和振荡提取[11])和提取时间(30,60,90,120 min)对样品中烟碱提取量的影响,结果见表1。

表1 提取方法和提取时间对样品中烟碱提取量的影响Tab.1 Effect of extraction method and extraction time on extracting amount of nicotine in sample

结果表明,采用索氏提取和振荡提取法提取30 min时,烟碱的提取量分别为11.7,10.5 mg·g－1,提取率分别为61%和55%;采用超声提取法提取30 min时,烟碱的提取量为18.9 mg·g－1,提取率达99%;当超声提取90 min时,烟碱可被完全提取。为提高分析效率,试验选择提取方法为超声提取,提取时间为30 min。

2.3 提取剂的选择

试验考察了不同提取剂[甲醇、50%(体积分数,下同)甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氢氧化钠的50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氢氧化钠的75%甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氢氧化钠的甲醇溶液、0.01 mol·L－1氢氧化钠溶液、0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液、95%(体积分数,下同)乙醇溶液]对样品中烟碱提取量的影响,结果见图2。

图2 提取剂对样品中烟碱提取量的影响Fig.2 Effect of extractant on extracting amount of nicotine in sample

结果表明,以含0.1 mol·L－1氢氧化钠的75%甲醇溶液为提取剂时,烟碱的提取效果较好,这是由于碱性溶液可以破坏植物细胞壁和细胞膜,使烟碱更容易被提取出来;但以0.01,0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液为提取剂时,烟碱的提取量均有所减少,可能是由于水相比例增大后,样品粉末的分散性变差,导致烟碱的提取率降低。因此,试验选择提取剂为含0.1 mol·L－1氢氧化钠的75%甲醇溶液。

2.4 称样量的选择

试验考察了样品称样量为0.1,0.2,0.5,1.0 g时对烟碱提取率的影响。结果表明,当称样量为0.1～0.5 g时,烟碱的提取率较高,而且基本保持不变;当称样量为1.0 g时,烟碱的提取率明显降低。为保证烟碱的提取效果,同时兼顾标准曲线的线性范围,试验选择样品称样量为0.5 g。

2.5 标准曲线和检出限

移取适量的烟碱标准储备溶液于一组容量瓶中,用甲醇逐级稀释,配制成烟碱质量浓度为3.00,6.00,12.5,25.0,50.0,100 mg·L－1的烟碱标准溶液系列,按照仪器工作条件进行测定。以烟碱的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,烟碱质量浓度在3.00～100 mg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程为y＝1.023×107x－8.752×103,相关系数为0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果得烟碱的检出限为0.5 mg·L－1。

2.6 精密度试验

采用气相色谱法(YC/T 246－2008)、分光光度法(GB/T 23225－2008)及本法对4个不同来源的烟草样品进行测定,计算测定值的日内(n＝6)和日间(n＝9)相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度试验结果Tab.2 Results of test for precision

结果显示,气相色谱法的日内RSD为0.58%～1.8%,日间 RSD为1.4%～2.5%;分光光度法的日内 RSD 为 1.7% ～2.2%,日间 RSD 为 2.0% ～2.8%;本法的日内 RSD 为 0.47% ～1.1%,日间RSD为0.44%～0.97%,表明本法精密度良好。原因可能是:气相色谱法在测定过程中振荡提取操作相对复杂,多个提取剂的加入以及振荡不充分均会造成结果的不稳定;分光光度法是通过水蒸气蒸馏进行提取,提取过程的稳定性较差;而本法采用超声提取,使用的提取剂种类少,操作步骤简单,结果稳定性好。