固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定葛根中11种黄酮苷元的含量

侯建波,谢 文,史颖珠,李 杰,汪 鹏,毛壬熠,张文华

(1.杭州海关技术中心,杭州 310016; 2.浙江省检验检疫科学技术研究院,杭州 310016;3.浙江立德产品技术有限公司,杭州 310016; 4.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,杭州 310058)

葛根具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效,常用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛和酒毒伤中。2000年葛根被国家卫生部正式批准为药食两用植物,可用于新型中药和功能性保健(食)品中[1]。

以葛根素、大豆苷、染料木素和染料木苷为代表的黄酮类化合物是葛根的主要有效成分,其中含量最高的是葛根素,《中华人民共和国药典》(2015年版)(简称Ch P 2015)将葛根素的含量作为衡量葛根质量的重要指标。目前,葛根中黄酮类化合物含量的测定方法主要有分光光度法[2-4]、液相色谱法[5-11]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12-13]和液相色谱-高分辨质谱法[14-16]等。由于黄酮类化合物种类较多,黄酮苷元可与糖类形成多种黄酮苷而普遍存在于植物体内[17],但各黄酮苷的含量不一,目前除了液相色谱-高分辨质谱法,其他分析手段较难全面获得黄酮类化合物的信息。

本工作筛选出葛根中11种主要的黄酮苷(葛根素-6″-O-木糖苷、甘草苷、大豆苷、野黄芩苷、大豆黄苷、芦丁、鸢尾苷、染料木苷、山萘酚-3-O-芸香糖苷、黄芩苷和刺芒柄花苷)及其对应的黄酮苷元(葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、鸢尾黄素、染料木素、山萘酚、黄芩素和刺芒柄花素),通过盐酸-乙醇溶液的混合液对葛根进行水解,提取其中的黄酮苷元,采用Waters HLB固相萃取柱净化,建立了LC-MS/MS测定葛根中葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、鸢尾黄素、染料木素、山萘酚、黄芩素和刺芒柄花素11种黄酮苷元含量的方法。该方法通过测定水解后样品中黄酮苷元的含量,可以更全面地反映葛根中各苷元所代表的黄酮类化合物的总量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1100型液相色谱仪;API 4000型三重四极杆串联质谱仪;Milli-Q Synergy 185型超纯水器;IKA MS3 Basic型涡旋器;24孔固相萃取装置;Heraeus Multifuge X1R型台式离心机;G&G JJ500型电子天平;Mettler AE260型电子天平。

单标准储备溶液:10 g·L－1,称取适量的大豆黄素、大豆素、槲皮素、刺芒柄花素等22种标准品,用甲醇溶解,配制成质量浓度均为10 g·L－1的单标准储备溶液。

11种黄酮苷元混合标准溶液:100μg·L－1,移取适量的葛根素、甘草素、大豆素、野黄芩素、大豆黄素、槲皮素、鸢尾黄素、染料木素、山萘酚、黄芩素、刺芒柄花素单标准储备溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为100μg·L－1的11种黄酮苷元混合标准溶液。

混合标准溶液:10μg·L－1,移取适量的22种黄酮苷和黄酮苷元单标准储备溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为10μg·L－1的混合标准溶液。

大豆黄素标准品纯度为98.2%,大豆素标准品纯度为99.0%,槲皮素标准品纯度为96.4%,刺芒柄花素标准品纯度为98.5%,染料木素标准品纯度为99.0%,甘草素标准品纯度为96.9%,黄芩素标准品纯度为99.2%,野黄芩素标准品纯度为96.2%,葛根素标准品纯度为87.0%,山萘酚标准品纯度为95.7%,鸢尾黄素标准品纯度为98.1%,大豆黄苷标准品纯度为92.9%,大豆苷标准品纯度为93.3%,芦丁标准品纯度为95.0%,刺芒柄花苷标准品纯度为99.0%,染料木苷标准品纯度为95.9%,甘草苷标准品纯度为96.9%,黄芩苷标准品纯度为96.8%,野黄芩苷标准品纯度为88.9%,葛根素-6″-O-木糖苷标准品纯度为100%,山萘酚-3-O-芸香糖苷标准品纯度为99.8%,鸢尾苷标准品纯度为98.8%。

甲醇、乙腈为色谱纯;甲酸为质谱纯;盐酸为优级纯;乙醇、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、L-(＋)-抗坏血酸均为分析纯;试验用水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Mightysil RP-18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3μm);柱温 25 ℃;流量0.4 mL·min－1;进样量20μL;流动相A为甲醇,B为0.15%(体积分数,下同)甲酸溶液,测定大豆苷、大豆黄苷和刺芒柄花苷时B为水。梯度洗脱程序:0～10.0 min时,A 由40%升至75%;10.0～15.0 min时,A 由75%升至90%,保持6.0 min;21.0～23.0 min时,A 由90%下降至40%,保持7.0 min。

2)质谱条件 电喷雾离子(ESI)源,离子源温度540℃;负离子扫描模式;多反应监测(MRM)模式;电喷雾电压－4 500 V;雾化气压力289 k Pa,气帘气压力310 kPa,辅助气压力172 kPa。其他质谱参数见表1,其中,“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1(续)

1.3 试验方法

称取葛根样品0.10 g于150 mL圆底烧瓶中,加入0.5 g TBHQ,36 mL 50%(体积分数,下同)乙醇溶液和4 mL盐酸,在氮气保护下,水浴加热回流120 min。水解结束后,冷却,用水定容至50 mL容量瓶中,取1 mL上清液,加入9 mL水,混合均匀,转移至经5 mL甲醇和5 mL 5%(体积分数,下同)甲醇溶液活化的 Waters HLB固相萃取柱中,用5 mL 20%(体积分数,下同)甲醇溶液进行淋洗,抽干,再用10 mL甲醇洗脱,控制流量为1～2 mL·min－1,收集全部洗脱液。将洗脱液用甲醇定容至10 mL容量瓶中,摇匀,用0.22μm有机滤膜过滤,取0.1 mL滤液,再用体积比为4∶6的甲醇-0.15%甲酸溶液的混合液定容至10 mL容量瓶中,混合均匀,按仪器工作条件进行测定,外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 水解条件的选择

通常采用浸提和回流两种方式对中草药中的有效成分进行提取。由于黄酮苷元容易被氧化,参考ChP 2015,试验考察了TBHQ、BHA、BHT和抗坏血酸等4种不同抗氧化剂对目标物的保护情况。结果显示:以BHA和BHT为抗氧化剂时,槲皮素、山萘酚、黄岑素的回收率均较低,可能是由于BHA和BHT在乙醇溶液中的溶解性较差,目标物容易被氧化;以抗坏血酸为抗氧化剂时,槲皮素、山萘酚的回收率较低;以TBHQ为抗氧化剂时,槲皮素、山萘酚、黄岑素的回收率均得到明显提升。进一步试验发现,当加入0.1 g TBHQ时,槲皮素和山萘酚的回收率均大于70%,而黄芩素的回收率较低;当加入0.5,1.0 g TBHQ 时,黄芩素的回收率可提升至70%左右。考虑到节约成本,试验选择抗氧化剂为0.5 g TBHQ。

同时,试验考察了不同体积分数(30%,50%,70%)的乙醇溶液对黄酮苷水解效果的影响。结果显示,乙醇体积分数对黄酮苷的水解没有明显影响,由于黄酮苷的水溶性较好,黄酮苷元的醇溶性较好,综合考虑,试验选择乙醇体积分数为50%。

在50%乙醇溶液中,加入一定量的盐酸,使盐酸体积分数分别为5%,10%,12.5%,并在氮气保护下水浴加热回流30,60,90,120,180 min进行试验。结果显示,当盐酸体积分数为10%,水解时间为120 min时,各黄酮苷可完全水解。因此,试验最终选择水解条件:抗氧化剂为0.5 g TBHQ,水解溶液为含10%盐酸的50%乙醇溶液,水解时间为120 min。在上述优化条件下,对10μg·L－1的11种黄酮苷元混合标准溶液进行测定,各黄酮苷元的回收率均大于80%,表明该水解条件下,各黄酮苷元可稳定存在。

2.2 净化条件的选择

在LC-MS/MS测定前,通常采用液液萃取、固相萃取、QuEChERS等方式净化样品,以降低背景干扰,减少基质效应的影响,从而提高结果的准确性。

按照试验方法,将水解后的样品溶液转移至CNW C18(500 mg/6 mL)、Waters C18(500 mg/6 mL)、Waters HLB(200 mg/6 mL)、Biocomma HLB(200 mg/6 mL)等4种固相萃取柱中,分别采用体积分数为10%,20%,30%,40%,50%的甲醇溶液对其进行淋洗。结果表明:采用C18固相萃取柱净化,当甲醇体积分数为20%时,仅葛根素被洗脱下来,而其他目标物均不会被洗脱;采用HLB固相萃取柱净化,当甲醇体积分数为50%时,仅葛根素被洗脱下来,而其他化合物均不会被洗脱。因此,试验选择20%甲醇溶液进行淋洗。接着,以甲醇为洗脱液,考察了上述4种固相萃取柱对11种黄酮苷元回收率的影响,结果见图1。

图1 固相萃取柱对黄酮苷元回收率的影响Fig.1 Effect of solid phase extraction column on recovery of flavonoid aglycones

结果表明,使用HLB固相萃取柱时,各目标物的回收率相对较高,并且Waters HLB固相萃取柱的稳定性较好,因此试验选择Waters HLB固相萃取柱,以20%甲醇溶液为淋洗液,以甲醇为洗脱液来进行净化。

2.3 色谱条件的选择

按照试验方法,考察了Mightysil RP-18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3μm)和Inertsil ODS-3色谱柱(150 mm×4.6 mm,3μm)对各目标物分离效果的影响。结果表明,以Mightysil RP-18色谱柱为固定相时,各目标物的分离效果相对较好,因此试验选择Mightysil RP-18色谱柱。

以Mightysil RP-18色谱柱为固定相,考察了甲醇或乙腈为流动相A,水或0.15%甲酸溶液为流动相B时各目标物的分离情况。结果表明:大部分目标物在甲醇中的色谱峰强度和峰形均优于在乙腈中的,考虑到与前处理净化的有效衔接,试验选择流动相A为甲醇;并且大部分目标物在0.15%甲酸溶液中的色谱峰强度和峰形均优于在水中的,而大豆黄苷以水为流动相B时,其色谱峰强度提高近10倍,大豆苷和刺芒柄花苷以水为流动相B时,其色谱峰强度提高近20倍。因此,对大豆黄苷、大豆苷、刺芒柄花苷进行分析时以水为流动相B,对其他黄酮苷和黄酮苷元进行分析时以0.15%甲酸溶液为流动相B。在上述优化条件下,对10μg·L－1的混合标准溶液进行分析,各目标物的分离情况如图2所示。

图2 黄酮苷和黄酮苷元的色谱图Fig.2 Chromatograms of flavonoid glycosides and flavonoid aglycones

2.4 质谱条件的选择

试验对各黄酮苷和黄酮苷元标准溶液进行稀释,采用流动注射的方式,在负离子模式下进行母离子全扫描,确定准分子离子峰,再以目标物的准分子离子为母离子,对其子离子进行全扫描。按照欧盟EC/657指令的要求,选择两个特征子离子,以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对,通过MRM模式优化质谱参数,各黄酮苷和黄酮苷元的质谱参数见表1。

2.5 基质效应

LC-MS/MS测定药物残留时,样品基质对目标物具有增强或抑制效应,从而影响测定结果的准确性。按照试验方法,对葛根样品进行处理得到葛根基质溶液,采用体积比为4∶6的甲醇-0.15%甲酸溶液的混合液(溶剂)和葛根基质溶液分别配制10μg·L－1的11种黄酮苷元混合溶液,按照仪器工作条件进样分析,记录各目标物在上述两种溶液中定量离子对的响应强度,并计算离子抑制率[离子抑制率(%)＝(基质响应强度－溶剂响应强度)×100%/溶剂响应强度][18],结果见表2。

表2 基质效应Tab.2 Matrix effect

结果显示,各目标物的离子抑制率均小于11%,说明无明显的基质效应,因此试验采用体积比为4∶6的甲醇-0.15%甲酸溶液的混合液配制的混合标准溶液系列制作标准曲线。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

移取适量的11种黄酮苷元混合标准溶液,用体积比为4∶6的甲醇-0.15%甲酸溶液的混合液逐级稀释,配制成各黄酮苷元质量浓度为1,2,5,10,20,50μg·L－1(相当于黄酮苷元的质量分数为0.05%,0.10%,0.25%,0.50%,1.00%,2.50%)的 混 合 标 准溶液系列,按照仪器工作条件进行测定,外标法定量。以各黄酮苷元的质量分数为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,各黄酮苷元的质量分数在0.05%～2.50%内与其对应的峰面积呈线性关系,线性参数见表3。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法对葛根样品进行3个浓度水平的加标回收试验(加入各黄酮苷标准溶液,相当于水解后0.25%,0.50%,1.00%的黄酮苷元),每个浓度水平测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4可知:黄酮苷元的回收率为75.0%～94.0%,测定值的 RSD为3.5%～12%。

2.8 样品分析

按照试验方法分别对经水解和未经水解的10个葛根样品进行测定,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of samples %

结果表明,葛根经水解处理后,甘草素、野黄芩素、槲皮素、鸢尾黄素、山萘酚、黄芩素未被检出,而葛根素、大豆素、大豆黄素、染料木素和刺芒柄花素的质量分数明显提高,说明黄酮苷和游离黄酮苷元在葛根中同时存在,本方法通过测定水解后的黄酮苷元,可更全面地反映该苷元所代表黄酮类化合物的含量。

本工作用含10%盐酸的50%乙醇溶液对葛根中的黄酮苷进行水解得到黄酮苷元,采用 Waters HLB固相萃取柱净化,建立了LC-MS/MS测定葛根中11种黄酮苷元含量的方法。该方法可更全面地反映葛根中各黄酮苷元所代表的该类黄酮类化合物的含量,对后续黄酮类物质含量及药物活性关系分析、葛根的品质及品种研究具有重要的辅助作用。