超高效液相色谱法同时测定绿茶茶汤中12种有效成分

胡 毅,王 微,兰吉玉,鄢人雨,刘文锋*

(1.贵州大学,贵阳 550025; 2.黔东南州农产品质量安全检测中心,凯里 556000)

中国是最早种植茶叶的国家,距今有6 000多年的历史[1]。绿茶是中国的主要茶类之一,通过采取茶树的新叶或芽,经杀青、整形、烘干等工艺制作而成。绿茶中含有茶多酚、咖啡碱、氨基酸、多糖等生物活性物质[2],这些成分对防衰老、杀菌、消炎等具有特殊效果[3]。准确测定茶叶茶汤中的有效成分对茶叶品质评价、茶叶加工、茶树选育等方面具有重要意义。

目前,测定茶叶中活性成分的常用方法有液相色谱-串联质谱法[4]、高效液相色谱法[5]、毛细管电泳法[6]和分光光度法[7]等。其中高效液相色谱法因分离效果好、测定结果准确的优点而被广泛应用,但该方法存在分析时间长、结构相似的物质分离度不高等问题。与传统的高效液相色谱法相比,超高效液相色谱法(UHPLC)具有分析快速、分离效果好、灵敏度高等优势[8]。

本工作建立了UHPLC同时测定绿茶茶汤中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素、没食子儿茶素、茶氨酸、咖啡因、可可碱等12种有效成分含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters型超高效液相色谱仪;SG 3200 HD型数控超声清洗机;ULTRA-TURRAX型分散机;TG-16-WS型离心机;JY5002型电子天平;DZKW-4型电热恒温水浴锅。

单标准储备溶液:分别称取适量标准品,用水溶解,配制成质量浓度为2.00 g·L－1的单标准储备溶液,于4～8℃保存5 d。使用时,分别移取上述单标准储备溶液,用水稀释,配制成所需质量浓度的单标准溶液。

混合标准溶液系列:分别移取适量的单标准储备溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,摇匀,配制成EC质量浓度为0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mg·L－1,GA、没食子儿茶素、可可碱、GCG、儿茶素、CG质量浓度为0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 mg·L－1,EGC质量浓度为2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 mg·L－1,茶氨酸、咖啡因、EGCG、ECG 质量浓度为5.0,10.0,20.0,50.0,100.0 mg·L－1的混合标准溶液系列。

EGCG标准品,纯度98.96%;GCG标准品,纯度99.35%;ECG 标准品,纯度98.58%;GA 标准品,纯度99.42%;CG 标准品,纯度99.51%;EC标准品,纯度99.63%;EGC标准品,纯度99.90%;儿茶素标准品,纯度98.33%;没食子儿茶素标准品,纯度98.82%;茶氨酸标准品,纯度98.61%;咖啡因标准品,纯度99.99%;可可碱标准品,纯度99.90%。

乙腈、甲醇均为色谱纯;其他试剂为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温30 ℃;进样量2μL;流量0.3 mL·min－1;二极管阵列检测器,检测波长210 nm;流动相A为0.01%(体积分数,下同)磷酸溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min时,A 为100%;1.0～10.0 min时,A 由100%降至85%,保持4.7 min;14.7～15.0 min时,A由85%升至100%。

1.3 试验方法

将1.00 g粉碎茶叶过40目(孔径0.425 mm)筛网后,用100 mL 90℃的水溶解,立即于90℃水浴中超声提取20 min。冷却至室温,再用水定容至100 mL,静置5 min。取上述样品溶液1 mL,用水定容至10 mL,以转速4 500 r·min－1离心5 min,取上清液,用0.22μm滤膜过滤,滤液按仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

试验考察了不同组合的水相(甲酸溶液、乙酸溶液和0.01%磷酸溶液)-有机相(甲醇、乙腈)为流动相时对12种目标物分离度的影响。结果表明:以甲醇为流动相时,儿茶素峰和咖啡因峰出现部分重叠,即使优化洗脱条件仍无法实现两峰的有效分离;以甲酸溶液-乙腈的混合液、乙酸溶液-乙腈的混合液为流动相时,ECG和CG较难分离;而采用0.01%磷酸溶液-乙腈的混合液为流动相时,ECG和CG的分离度有明显改善。因此,试验选择流动相为0.01%磷酸溶液-乙腈的混合液。

2.2 洗脱条件的选择

由于茶叶中多酚类成分性质相似,同时儿茶素与咖啡因出峰时间易重合,流动相确定后,洗脱条件的选择十分重要。结果表明:提高流动相中0.01%磷酸溶液的初始比例,有利于茶氨酸的分离,当0.01%磷酸溶液的初始比例小于95%时,茶氨酸不能与溶剂峰(水)分离;当0.01%磷酸溶液的初始比例提高至100%时,茶氨酸与溶剂峰能够有效分离。因此,试验选择洗脱条件为梯度洗脱,梯度洗脱程序见1.2节。

2.3 检测波长的选择

用二极管阵列检测器在波长190～500 nm内进行扫描。结果表明:当检测波长为210 nm时,各目标物均有较好的紫外吸收,仪器基线平稳,杂峰较少,可满足检测的要求,因此试验选择检测波长为210 nm。

2.4 色谱行为

按上述优化条件对各目标物质量浓度为1.0 mg·L－1的混合标准溶液中12种有效成分进行测定,其色谱图见图1。

图1 色谱图Fig.1 Chromatogram

由图1可知,12种有效成分在16 min内均全部出峰,且分离度较好。

2.5 标准曲线和检出限

按照试验方法对混合标准溶液系列进行测定,以12种有效成分的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。12种有效成分的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度和稳定性试验

按照试验方法对各目标物质量浓度为1.0 mg·L－1的混合标准溶液进行测定,连续测定6次,记录12种目标物的保留时间和峰面积,并计算相对标准偏差(RSD),考查方法的精密度,结果见表2。

按照试验方法对同一样品溶液于0,4,8,16,24 h进行测定,记录12种目标物的峰面积,并计算RSD,考查方法的稳定性,结果见表2。

表2 精密度和稳定性试验结果Tab.2 Results of tests for precision and stability %

2.7 回收试验

按照试验方法对1 mL茶汤样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,加标量为1 mL茶汤中各待测组分含量的0.5～2.0倍,每个浓度水平平行测定6次,计算各目标物的回收率,结果见表3。

表3 回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

表3(续)

2.8 样品分析

按照试验方法对市售的茶叶样品进行分析。结果显示,12种有效成分均被检出,各成分检出量见表4。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of sample

绿茶中含有氨基酸类、生物碱、儿茶素类等多种活性成分,儿茶素类物质结构、性质相似度高,分离难度大,并且茶氨酸与儿茶素类物质结构、性质的差异大,同时测定茶氨酸、生物碱、儿茶素类成分存在一定难度。本工作建立了UHPLC同时测定绿茶茶汤中12种有效成分的方法,该方法在16 min内可将各目标物较好地分离,精密度、稳定性、回收试验结果表明该方法准确、可靠。