通城虎组织培养技术

潘丽梅 黄芩芬 陈乾平 万凌云 付金娥 韦树根

(广西壮族自治区药用植物园 广西南宁 530023)

马兜铃科马兜铃属植物通城虎（Aristolochia fordiana Hemsl.），别名五虎通城、定心草、万丈藤、大散血、血蒟等，生于灌丛或石隙，分布于浙江、江西等地，广西是其主产区之一［1］。通城虎味苦、辛，性温，有小毒，有解毒消肿、祛风镇痛、行气止咳之效，主治风湿骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打损伤、小儿惊风、毒蛇咬伤［2-3］。野生的通城虎资源通常分布于丘陵林下灌木丛中或者周边石隙中，对生长环境有一定的要求，因此导致分布范围并不广泛。目前国内外对通城虎研究极少，尤其对其繁殖方面的研究少之又少，且多限于化学成分及药理毒性相关研究［3-5］。近年来随着通城虎资源的不断减少及市场需求量的不断增加，对野生资源的采集量逐渐增大，导致野生通城虎资源的破坏甚至濒临枯竭。通过组织培养快繁技术，可以有效地利用通城虎的种质资源并快速增加其繁殖系数，不仅能满足中药市场对通城虎药材的需求，更有利于通城虎资源的保护。因此，本研究以通城虎植株幼嫩茎段为外植体，探讨不同消毒时间及含不同生长调节物质的培养基对通城虎茎段污染、褐化及出芽、生根的影响，以期为通城虎的组织培养快繁提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

试验材料采自广西药用植物园科研基地种质资源圃，采集通城虎带有嫩叶的幼嫩茎段，去除多余的老叶后用自来水流水冲洗干净备用。

1.1.2 试剂

主要试剂包括MS培养基、1/2 MS培养基、升汞、75%酒精、2%次氯酸钠；生长素类似物α-萘乙酸（NAA）、引哚丁酸（IBA）以及2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）；细胞分裂素6-苄氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）。

1.2 方法

1.2.1 灭菌方式及灭菌时间的确定

将所采集的枝条剪成1.0～2.0 cm长的带芽茎段，去掉多余叶片，保留叶柄基部；在加有1%洗洁精的洗涤液中浸泡10～15 min，再用慢流水冲洗15 min；使用4种不同的灭菌方式对外植体进行灭菌处理，分别如下：用75%酒精浸泡（处理1）；用0.1%升汞溶液浸泡（处理2）；先用75%酒精浸泡10～30 s再用0.1%升汞溶液浸泡（处理3）；用2%次氯酸钠溶液浸泡（处理4）。浸泡时间均分别设置为4、6、8、10 min，最后用无菌水冲洗4～5次，取出后用灭菌后的纱布吸干表面水分，切去茎段两头部位，接种在常规的MS培养基中；接种15 d后，统计污染率和成活率，筛选出合适的消毒剂及消毒时间。

1.2.2 初代诱导

按完全随机试验设计，将经过预处理后的外植体茎段接种到含有不同类型和配比的植物生长物质的培养基中，每个处理接种20瓶，每瓶接种1个茎段，重复3次，随时观察记录茎段的萌芽率、芽生长状况等。

1.2.3 增殖培养

选取初代诱导中萌发后生长状况一致的组培苗，切取1 cm左右的芽苗接种到含有不同类型及不同浓度激素（6-BA、NAA、IBA）的培养基中进行增殖培养，每个处理接种5瓶，每瓶接种3个芽苗；随后观察记录芽苗的增殖及生长情况，筛选出最适合通城虎组培苗增殖培养的激素组合。

1.2.4 生根培养

经增殖培养后，选取生长健壮、高约2 cm的增殖苗转入生根培养基中进行生根培养。生根培养基采用1/2 MS培养基附加不同浓度的IBA（0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L） 和 NAA （0.2、0.5、1.0 mg/L），每个处理接种5瓶，每瓶接种3个增殖苗；观察记录生根情况及整株生长状况。

1.2.5 炼苗基质筛选

将完成生根的组培苗移出培养室，开盖炼苗后进行移栽，研究不同基质处理对组培苗移栽成活率的影响，以期对通城虎种苗的大规模生产提供理论参考。不同基质处理如下：（1）轻基质；（2）轻基质∶河沙∶珍珠岩＝5∶3∶1（V∶V∶V，下同）；（3）塘泥；（4）塘泥∶河沙∶珍珠岩＝5∶3∶1；（5）育苗土；（6）育苗土∶河沙∶珍珠岩＝5∶3∶1。移栽后搭设遮阳网，观察记录移栽苗成活率及生长状况，筛选适合通城虎组培苗移栽的最佳基质。

2 结果与分析

2.1 灭菌方式及灭菌时间的确定

由表1可以看出，不同的灭菌方式及灭菌时间处理对通城虎外植体的灭菌效果影响差异明显，仅用75%酒精浸泡的处理污染最严重，成活率也最低，不适合通城虎外植体的灭菌处理，灭菌时间过短也达不到灭菌效果；75%酒精和升汞的组合处理效果较好，随着处理时间的延长，灭菌效果越长，但时间过长也会影响成活率。综合考虑污染率和成活率，处理3灭菌效果较好，即先用75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min；其次是处理2和处理4。

表1 不同灭菌方式及灭菌时间对通城虎组织培养污染率和成活率的影响 单位：%

2.2 不同激素处理对通城虎初代诱导的影响

由表2可知，不同激素处理对通城虎茎段的初代诱导有不同的影响。单独使用6-BA诱导效果较差；而6-BA与KT组合使用则诱导效果较好，其中，6-BA浓度达到1.0 mg/L时，添加不同浓度的KT和2，4-D诱导效果最好，当6-BA浓度超过1.5 mg/L时，诱导效果反而下降。2，4-D在诱导愈伤组织方面的作用更为明显，因此综合芽诱导的启动时间及诱导率可知，处理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L）诱导效果最好，诱导率达100%。

表2 不同激素处理对通城虎初代诱导的影响

2.3 不同激素处理对通城虎增殖培养的影响

不同激素处理对通城虎丛生芽增殖分化的影响不同，激素浓度的高低直接影响其增殖系数和芽长势。由表3可以看出，将通城虎接种于不含任何激素的空白培养基中，无增殖效果。在相同6-BA浓度下，添加少量IBA可明显提高芽的增殖系数，但NAA的使用对增殖的影响不大。同时，随着6-BA浓度的增加，虽然也有一定的增殖效果，但也极易出现絮状愈伤组织，影响成苗。因此最佳的激素浓度组合为6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.5 mg/L，即处理6，其增殖系数最高，为（5.53±1.68），且芽生长健壮，叶绿，适合下一步的生根炼苗。

表3 不同激素处理对通城虎增殖培养的影响

2.4 不同激素组合对通城虎生根培养的影响

不同的激素处理都能诱导组培苗生根，但不同的激素浓度生根效果有较大差异。由表4可以看出，MS培养基不适合生根，生根率低且生长弱，比较适合生根的是1/2 MS培养基；随着激素使用浓度的加大，生根效果越好，但是当IBA和NAA浓度都在1.0 mg/L时，虽然生根效果不错，但根部易出现絮状愈伤组织，影响移栽成活率。因此，最适合通城虎生根的是处理5（6-BA 1.0 mg/L＋KT 1.0 mg/L＋2，4-D 0.5 mg/L），生根率达到96.33%。

表4 不同激素组合对通城虎生根培养的影响

2.5 不同基质对通城虎组培苗移栽效果的影响

适合的移栽基质不仅能提高组培苗移栽成活率，也能提高幼苗生长质量。由表5可以看出，处理1的轻基质最适合通城虎组培苗的移栽，成活率达到96%以上，且生长状态良好。轻基质的成分主要为泥炭土、珍珠岩和蛭石，无需混合其他基质即能满足组培苗的移栽种植；单独的育苗土或者塘泥不适合通城虎组培苗的移栽。

表5 不同基质对通城虎组培苗移栽效果的影响

3 讨论与结论

组织培养前必须进行茎段灭菌处理，不同的物种类型（如木本、草木）以及茎段的幼嫩程度等都对灭菌方式及灭菌时间有不同的要求。同科属其他植物的组织培养中，马兜铃用12.5 mol/L的乙醇消毒30 s，然后再用0.05%的升汞消毒10～18 min才达到灭菌效果［6］；而贯叶马兜铃的幼嫩茎段则是先用5%酒精浸泡30～40 s，再用0.1%升汞溶液浸泡3 min，方可达到灭菌效果［7］。本试验中，通城虎幼嫩茎段经75%酒精浸泡10～30 s，再用0.1%升汞溶液浸泡8 min，灭菌效果较佳。除了灭菌剂的使用浓度不同外，试验中所采集茎段的幼嫩程度也可能不一样，越幼嫩的茎段，灭菌剂处理时间应越短。

不同的植物生长物质是植物组织培养中不可或缺的因子，6-BA和KT都是植物组织培养中常用的细胞分裂素。在本研究中，单独使用6-BA的诱导效果较差，与黄果西番莲［8］、南瓜［9］、白木通［10］等的研究结果相似，当在添加6-BA基础上添加不同浓度的KT和2，4-D可达到较好的诱导效果，但2，4-D不宜过高，否则容易长愈伤组织，从而影响出芽。增殖培养是组织培养的关键，是培养健壮生根苗的基础。本研究中，6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.5 mg/L的组合增殖系数最高，达到5.53，但NAA对通城虎的增殖培养没有明显作用。6-BA作为增殖培养的主导因子，其浓度对增殖培养有明显的促进作用，但浓度过高也容易诱发愈伤组织，因此适合的6-BA浓度至关重要，这与白木通［10］、海棠［11］等的研究结果一致。

组培苗的生根及移栽是植物组织培养体系最后的也是最关键的环节，生长素IBA与NAA组合更有利于生根，但需要适合的浓度。本研究中，当IBA和NAA的使用浓度超过1.0 mg/L时，容易出现愈伤组织，不利于根系形成及后续移栽。同时本研究也发现，MS培养基不适合生根，可能是营养过剩，促进了营养生长，但影响了根系生长，与香鳞毛蕨［12］等的研究结果一致。在组织培养中，基质类型和配比是组培苗成活与否的重要因素。本研究中，轻基质即能满足移栽需求，轻基质的成分主要为一定比例的泥炭土、珍珠岩和蛭石，若另外再加入河沙和珍珠岩，移栽效果反而下降，可能是过度透水引起；塘泥、育苗土单独使用不适合移栽，原因可能与其不透水性有关。因此，适合的移栽基质需要具备保水而又不过度积水的特性，这样方可更好地满足组培苗的移栽需求。本研究从通城虎茎段无菌材料的获得、芽诱导、继代增殖及生根、移栽等整个过程，首次成功建立了通城虎带芽茎段的组培再生体系，为通城虎的工厂化育苗及遗传转化奠定基础。