外泌体microRNA在结直肠癌诊断与治疗中的研究进展

徐智妍，马志斌，朱学丹，裴阳，姚艳文

【提要】 结直肠癌是常见恶性肿瘤之一，结直肠癌治疗的高成本和患者生活质量的下降给每个国家都增加了社会经济和医疗负担。为了能早期防治结直肠癌，开展液体活检与靶向治疗新技术在肿瘤精准医疗中显现出巨大潜力；其中，关于外泌体microRNA（miRNA）的临床前研究具有重要意义。miRNA是一类具有转录后调控功能的短链非编码RNA，是不同疾病特别是癌症的关键调节因子。外泌体是多种细胞分泌、介导细胞间通讯的微小囊泡。外泌体内包含高水平的miRNA，是体液中miRNA的理想来源与天然纳米级载体。众多证据表明外泌体miRNA参与机体多种生理和病理过程，在结直肠癌的发生发展中产生重要作用，外泌体miRNA的独特表达谱与联合作用可能成为未来结直肠癌诊断与治疗的关键手段。本文将外泌体miRNA在结直肠癌中早期诊断、动态监测、靶向治疗与化疗耐药等方面临床应用的研究热点进行综述。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因［1］，是一种由遗传和环境因素所致的异质性疾病［2］。CRC的病理生理机制主要是基因表达的改变，导致多条信号通路和细胞因子表达的失调。晚期CRC联合治疗易产生抗药性，使转移成为死亡的主要原因，五年存活率约为60%［3］。早期诊断可明显降低CRC死亡率，但大多数患者直到后期才出现症状。而常用的筛查方法结肠镜是一种侵入性检查，存在一定的操作不适、患者依从性低等问题［4］，确诊时往往已错过最佳治疗时机，导致治疗难度加大、晚期化疗耐药、预后差等一系列问题。进一步分析CRC发生、发展和扩散机制，开发强有力的血液筛查等早期诊断方法及基因疗法，有望降低其发病率和死亡率。许多研究已证明miRNA调控是驱动CRC发生和发展的重要基本过程之一，参与CRC起始、进展和凋亡的信号通路，可能作为CRC诊断、评估预后、疗效的生物标志物和治疗靶点［5］。但体液中的miRNA易被核酸酶降解，限制了其检测的准确性和临床药物应用［6］。近期研究结果显示外泌体miRNA在肿瘤的早期诊治中具有极其广阔的应用前景。外泌体是miRNA的天然富集体，可保护miRNA免受RNA酶活性的影响，而且具有免疫原性和细胞毒性低、稳定性和生物相容性高等优点［7］。外泌体miRNA的表达水平与癌症进展密切相关，可作为肿瘤诊断的非侵入性生物标志物［8］。外泌体miRNA是肿瘤-宿主通讯的重要介导者，可作为安全有效的靶向给药系统［9］。关于外泌体miRNA的研究可能很快就会应用于肿瘤临床治疗，因为很多研究正在开发使用miRNA模拟物或拮抗剂递送的新治疗方法，正进行多项关于使用miRNA治疗CRC的临床试验，且越来越受到生物制药公司的关注［10］。因此，本文将外泌体miRNA在CRC诊断与治疗中的应用价值和最新研究热点进行综述。

1 miRNA

1.1 miRNA的生物学功能

miRNA是单链非编码RNA，大约由18～25个核苷酸组成［11］。miRNA与目标信使RNA（Messenger RNA，mRNA）序列的3'非翻译区（3'UTR）互补结合，抑制［12］mRNA的翻译或诱导其降解而发挥作用，参与多细胞生物体中基因表达的转录后调节［13］。miRNA具有多靶点潜能，单个miRNA可与多个靶点相互作用，miRNA通过调控不同的靶点产生致癌或抑癌作用［14］。miRNA不仅影响肿瘤细胞，还可以调控促肿瘤的基质细胞，如成纤维细胞和内皮细胞［15］。此外，miRNA是CRC代谢重编程的重要调节因子，通过促进或抑制某些效应因子介导癌症代谢改变［16］。

1.2 miRNA与CRC的研究

miRNA广泛分布于全身各处，miRNA表达谱能区分组织类型和疾病状态，表现出组织特异性［17］。Marcuello等［18］研究发现一组血浆miRNA标志物可以区分CRC、结直肠腺瘤患者和健康人，将多个血浆标志物与粪便血红蛋白浓度联合检测可提高CRC筛查准确度。有研究证明CRC组织中的miR-888可以作为CRC诊断的潜在标志物，也可评估患者分化程度、浸润深度的预后效果［19］。

miRNA可以在转录后水平阻止蛋白表达并影响与癌症相关的通路，几乎在CRC的发病、进展到转移的所有阶段都有作用［20］。Li等［21］研究发现miR-574-3p的上调可能通过靶向癌基因Cyclin D2抑制CRC细胞的增殖和迁移，促进CRC细胞的凋亡。一些学者证实抑癌基因P53通过促进miR-374b并抑制AKT1蛋白对DNA损伤的反应，以调节博来霉素化疗诱导的CRC细胞凋亡［22］。在CRC中，一些已知的基因经常失活（APC、TGFBR2、TP53、SMAD4、PTEN）、组成性激活（KRAS）或过表达（MYC）。已经发现miRNA介导的这些基因调节CRC细胞转化的特征，而许多miRNA也在这些因子的下游发挥作用［23］。

miRNA因其在肿瘤中的独特表达谱和关键调控作用，在CRC的诊断、预后、预测复发、药物反应和靶向治疗方面显示出重要的应用前景［24］。

2 外泌体概述

2.1 外泌体的生物学特性

外泌体是直径在40～150 nm之间的胞外小泡，可由多种细胞产生、分泌，包含miRNA、mRNA、DNA和蛋白质等，有一层脂质双层膜［25］。外泌体也存在于各种生物体液中，包括血液、尿液、唾液、支气管肺泡灌洗液、腹水等［26］。在细胞膜内陷形成内体转变为成熟多囊泡小体（multivesicular body，MVB）的过程中，内体膜向腔内出芽形成腔内囊泡（intraluminal vesicle，ILV），同时将miRNA等成分吞没并封闭在小囊泡中，MVB与细胞膜融合将ILV释放到细胞外，即形成外泌体［27］。外泌体可吞噬细胞，或通过脂质的融合过程与受体细胞结合，介导细胞间通讯［28］。外泌体是蛋白质、核酸和其他生物活性化合物的有效载体，参与肿瘤生长、转移和免疫反应等多种生物学事件［29］。

2.2 外泌体介导的肿瘤微环境调控

肿瘤微环境由异质性肿瘤细胞和多种宿主细胞等构成，各成分之间相互作用，以促进疾病的发展。肿瘤细胞分泌的外泌体是正常健康细胞的10倍以上，通过对肿瘤分泌的外泌体及其内容物分析可以提供有关肿瘤动态环境的大量信息［30］。癌症衍生的外泌体有助于肿瘤微环境的形成和重新编程，操纵局部及全身环境，调节肿瘤血管生成，帮助癌症生长和扩散［31］。外泌体也可以对免疫系统进行编程，以引发抗肿瘤反应［28］。外泌体内包含高水平的miRNA，miRNA以癌细胞调控分子为靶标参与癌细胞和肿瘤微环境之间复杂的信号网络，通过外泌体分泌影响癌细胞的生长和转移，共同参与细胞间直接信号和旁分泌信号传递［32］。

3 外泌体、miRNA与CRC

3.1 外泌体miRNA在CRC中作为标志物的价值

肿瘤细胞产生的外泌体因包含miRNA等特异性标志物，可能具有筛查、监测肿瘤的价值。有学者研究发现miR-146a-5p是CRC干细胞外泌体中的主要miRNA，通过靶向调控CRC细胞中的Numb蛋白而促进干细胞样特性和致癌性，血清外泌体miR-146a-5p可作为诊断CRC、治疗前动态监测的生物标志物［33］。Liu等［34］实验证实CRC患者血浆外泌体miR-139-3p的表达水平与健康对照组相比显著下调，转移性CRC患者血浆外泌体miR-139-3p水平明显低于非转移性CRC患者，且与浸润深度、生存期有关，提示血浆外泌体miR-139-3p含量可能与CRC进展负相关，是CRC的新型标志物。Fu等［35］分析人原代CRC细胞系SW480和高转移细胞系SW620分泌的外泌体miRNA表达谱，发现CRC患者外周血外泌体中miR-17-5p和miR-92a-3p的高表达水平与患者的病理分期和分级显著相关。循环外泌体miRNA有望成为CRC初期诊断、动态检测、预后及治疗效果评价的无创性标志物。

3.2 外泌体miRNA在CRC中的靶向治疗通路

Mizoguchi等［36］研究发现miR-8073存在于外泌体中且主要从CRC细胞分泌，将合成的miR-8073模拟物引入异种移植小鼠结直肠肿瘤中可以抑制肿瘤的生长，它可以直接靶向调节细胞周期、增殖和抗凋亡的多个因子（FOXM1、MBD3、CCND1、KLK10和CASP2），共同发挥抗肿瘤增殖作用。一些学者实验表明，miR-128-3p可以通过外泌体传递到CRC细胞系HCT-116和SW480细胞，通过直接抑制其下游靶基因FOXO4激活转化生长因子-β／Smad和JAK／Stat3信号来促进CRC细胞上皮细胞-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT），干扰外泌体miR-128-3p和过表达FOXO4可抑制CRC细胞的存活、迁移与侵袭，从而达到治疗CRC目的［37］。

已有研究证实外泌体miRNA通过介导多种信号通路在CRC血管生成中发挥作用，调控肿瘤形成、进展和转移过程中的肿瘤纤维化和血管生成。高表达转化生长因子-β1的肿瘤外泌体可以触发成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，促进肿瘤血管生成和肿瘤进展［38］。Zhang等［39］的研究用转化生长因子-β1处理CRC细胞HCT-116，外泌体miR-200b的水平以剂量依赖的方式增加，miR-200b靶向降低细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（p27／kip1）的表达水平，促进肿瘤生长和转移。p27／kip1在HCT-116细胞中的过表达可有效抑制外泌体miR-200b诱导的肿瘤细胞增殖。Shang等［40］发现来源于CRC细胞HT29的外泌体miR-183-5p通过靶向下调FOXO1，使人微血管内皮细胞株（HMEC-1）细胞的增殖、迁移和成管能力显著增强，从而促进了CRC的发生，FOXO1过表达能够逆转外泌体miR-183-5p诱导的血管生成相关蛋白的上调。Hu等［41］研究表明CRC细胞分泌的外泌体miR-1229通过介导HIPK2／VEGF通路促进人脐静脉内皮细胞的愈合迁移和跨孔迁移，从而促进肿瘤的血管生成，外泌体miR-1229抑制剂可有效抑制裸鼠移植瘤的生长和血管生成。外泌体miRNA可能成为一种抑制肿瘤血管生成的治疗靶点。

远处转移是CRC主要死亡原因，放、化疗成为晚期CRC主要治疗方案，由此产生化疗耐药、副反应等问题，研究其转移、耐药机制，为晚期患者开发更具个性化治疗方案。Wang等［42］首次阐明了来自高转移性CRC细胞系HT-29的外泌体可以显著增加低转移性CRC细胞系Caco-2在小鼠肝脏的转移负荷和分布，机制可能与SDF-1／CXCR4生物轴有关，外泌体可能通过影响CRC细胞的迁移而促进转移。一些学者研究结果显示衍生自转移CRC细胞系SW620的外泌体miR-335-5p通过靶向Ras p21蛋白激活因子1（RASA1）促进EMT，从而促进CRC细胞的侵袭和转移，RASA1过表达可阻断外泌体miR-335-5p对CRC细胞迁移、侵袭和EMT的促进作用，RASA1可能成为CRC转移的潜在治疗靶点［43］。Webber等［44］报道一组含有miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p和miR-96-5p的血清外泌体miRNA可以明显区分晚期CRC患者和化疗耐药患者，并且靶向下调这些miRNA可增加对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的化疗敏感性，可以作为提高晚期CRC化疗药物疗效及预测能力的生物标志物。Xu等［45］表明外泌体miR-46146通过靶向凋亡相关蛋白PDCD10作为奥沙利铂化疗耐药的重要介导物，有可能成为提高CRC细胞对奥沙利铂敏感性的潜在靶点。

因此，可通过靶向调控外泌体miRNA介导的信号转导通路，开发新型基因靶向疗法。

3.3 外泌体miRNA在CRC中的递送系统

当miRNA 作为抗癌作用药物被运送时，血清中的miRNA不稳定且无法穿过生物膜。为了避免miRNA被血液清除、酶降解和细胞内捕获，有必要使用输送系统以增强保护作用和特定的细胞靶向性，需要开发有效的体内传递工具［31］。外泌体不仅是miRNA的理想来源，也是细胞间通讯的天然纳米载体。外泌体从细胞中自然衍生出来，通过分子生物学特性获得肿瘤靶向能力。相对于人工纳米载体，外泌体在循环中的时间更长，在血清中更稳定，靶向深层肿瘤细胞的机会显著增加［46］。外泌体内特有的蛋白质在其表面表达细胞识别分子，有助于选择性地靶向并被受体细胞摄取［47］。外泌体递送miRNA是细胞间信号交流的重要途径，外泌体与细胞膜融合，将miRNA直接释放到细胞质中，使其免受细胞外RNA酶或环境因素的破坏［48］。因此，外泌体miRNA可作为安全有效的靶向给药系统。

一些学者将miR-128-3p转染人正常结直肠黏膜细胞，miR-128-3p可高效表达并且被包裹到外泌体中，外泌体将miR-128-3p递送到奥沙利铂耐药的CRC细胞中，并通过Bmi1和MRP5基因的负调控增强CRC细胞对奥沙利铂化疗药敏感性［49］。Yao等［50］实验研制了一种基于人胚胎肾细胞系HEK293T的外泌体miRNA递送囊泡，外泌体包裹抑癌因子miR-204-5p，有效地抑制了CRC细胞增殖，诱导细胞凋亡，逆转化疗耐药。Liang等［51］利用基因工程改造外泌体将化疗药5-氟尿嘧啶和miR-21小分子抑制剂共同传递至耐药CRC细胞，可促进耐药细胞株对5-氟尿嘧啶的摄取，并能显著下调耐药细胞株中miR-21的表达，抑制肿瘤细胞增殖。天然纳米级载体外泌体有望克服传递系统的生物障碍，靶向运输miRNA模拟物或拮抗剂，诱导肿瘤细胞凋亡或抑制转移的信号通路，协同治疗CRC。

4 小结与展望

目前外泌体miRNA在CRC中的临床应用仍然面临许多因素的挑战，如提纯、检测方法缺乏标准化与临床实用性，筛查指标敏感性及特异性不足，未完全阐明外泌体miRNA与CRC细胞间通讯、靶向、表达及调控等作用机制，递送药物的安全高效性还有待证实。因此，运用灵敏可靠的测量方法全面筛选外泌体miRNA，精确分析相关信号转导通路及分子机制，以及选择正确有效的标志物、治疗靶点和递送系统是今后研究的重点。我们相信对外泌体miRNA的不懈探索将会开创更广阔的应用前景，在CRC诊断与治疗等领域中取得突破性进展。